2.2 Исследование реакции культуры клеток стромы роговицы и кадаверной роговицы человека на введение экспериментальных образцов

    2.2.1. 2D культивирование клеток стромы роговицы человека в присутствии изучаемых образцов гелевых окрашенных имплантатов (in vitro)

    Выделение и культивирование клеточной культуры кератоцитов

    Для выделения 2D клеточной культуры кератоцитов из Глазного тканевого банка ФГАУ НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России было получено три корнеосклеральных диска не пригодных для трансплантации, время от момента смерти до ввода в эксперимент не превышало 18 часов, возраст доноров не превышал 70 лет, показатель трансплантабельности по С.А. Борзенку 2А.

    Полученные корнеосклеральные диски механически очищали от эпителия и эндотелия с подлежащими мембранами, далее круглым роговичным трепаном диаметром 8 мм выкраивали центральную стромальную зону. Выделенную зону измельчали гистологическим ножом (Termo fisher scientific, США) до получения фрагментов не более 1мм2, далее полученную массу переносили в коническую пробирку типа Эппендорф (Genn Follower, США) с добавлением раствора коллагеназы II (Termo fisher scientific, США) типа 10 нг/мл в DMEM/F12 (Termo fisher scientific, США). Пробирку помещали в термошейкер (Biosan, Латвия) 800 rpm, 37 0С, 25 мин. Далее образец 3-х кратно промывали раствором фосфатно-солевого буфера (Termo fisher scientific, США) и переносили в чашки Петри (SPL Lifesciences, Корея) диаметром 35мм для дальнейшего культивирования [50].

    Для 2D культивирования кератоцитов использовали полную питательную среду на основе DMEM/F12 (Termo fisher scientific, США) с добавлением 10% бычьей фетальной сыворотки (Termo fisher scientific, США), 1% раствора антибиотиков (Termo fisher scientific, США), 2 мМ L-глутамина (ПанЭко, Россия). Культивирование проводили при стандартных условиях 37 0С, 5% CO2. Смену культуральной среды осуществляли каждые 3 суток.

    Пассирование клеточной культуры производили по достижению 80% конфлюэнции с использованием 1,5 мл TrypLE (Termo fisher scientific, США), экспозиция 10 мин при 370С, полученную клеточную суспензию переносили в 15мл центрифужную пробирку (SPL Lifesciences, Корея) с добавлением 3 мл полной питательной среды. Образцы центрифугировали (Termo fisher scientific, США) при 1200 rpm, 370C в течение 5 мин. Далее супернатант удаляли вакуумным насосом (Biosan, Латвия), осадок ресуспендировали в 1 мл полной питательной среды. Для подсчета количества клеток использовали автоматический клеточный счетчик Luna II (Logos Biosystems, Южная Корея).

    Клеточную культуру в концентрации 1,5х105 клеток/мл переносили в культуральные матрасы 25 см2 (SPL Lifesciences, Корея) с добавлением 5 мл полной питательной среды. По достижению культурой 3 пассажа изучали фенотип полученной клеточной культуры методом иммуноцитохимического анализа с последующим проведением эксперимента с формированием контрольной и опытной групп.

    Иммуноцитохимический анализ

    Для определения фенотипа культуры клеток проводили иммуноцитохимическое исследование. Для этого полученную клеточную культуру 3 пассажа переносили в концентрации 1х104 клеток/мл в лунку слайд флакона (SPL Lifesciences, Корея) с добавлением 0,5 мл полной питательной среды. Культивирование производили в течение 4 дней при стандартных условиях, смену питательной среды осуществляли на 2-ой день культивирования. По достижению 85-90% конфлюэнции клеточная культура 3-х кратно промывалась стерильным раствором фосфатно-солевого буфера (Termo fisher scientific, США) в течение 5 мин с последующей фиксацией в нейтральном (pH=7.0) 10% растворе формалина (ПанЭко, Россия) в течение 10 мин. Пермобилизацию клеток проводили раствором PBST (0,3% Triton X100 (Диаэм, Россия) + фосфатно-солевой буфер (Termo fisher scientific, США)) в течение 15 мин. Для определения характерного фенотипа кератоцитов использовали следующие первичные антитела: Кератокан (SantaCruzBiotechnology, США), Кератан сульфат (SantaCruzBiotechnology, США), Люмикан (Abcam, Великобритания), a-гладкомышечный актин (Abcam, Великобритания). Инкубирование с первичными антителами производили при комнатной температуре в течение 60 мин с последующим 3- х кратным отмыванием раствором фосфатно-солевого буфера (Termo fisher scientific, США) в течение 5 мин. Для детекциии первичных антител использовали вторичные антитела Alexa Fluor (AF) 488 (Abcam, Великобритания) и Alexa Fluor 594 (Abcam, Великобритания), инкубацию с которыми проводили в темноте при комнатной температуре в течение 60 мин с последующим 3-х кратным промыванием раствором фосфатно-солевого буфера (Termo fisher scientific, США) в течение 5 мин. Контрастирование ядер производили красителем Hoechst 33258 (Abcam, Великобритания), инкубирование с красителем составило 15 мин при комнатной температуре в темноте. Анализ образцов проводили на лазерно-сканирующим конфокальном микроскопе Olympus FV 10i (Olympus, Япония).

    Анализ воздействия образцов гелевых окрашенных имплантатов на 2D клеточную культуру

    Для оценки воздействия изучаемых имплантатов был проведен анализ «ДНК-комет» и определена пролиферативная активность клеточной культуры кератоцитов. Для этого полученная клеточная культура 3 пассажа культивировалась в 24 луночных планшетах (SPL Lifesciences, Корея) в концентрации 1.5х104 с добавлением 2 мл полной питательной среды. Спустя 3 суток культивирования формировали 3 опытные и контрольную группы. В опытные группы вносили по 1 мл изучаемого образца имплантата – Образец 1 (на основе гиалуроновой кислоты), Образец 2 (на основе гидролизата коллагена), Образец 3 (на основе метилцеллюлозы), контрольная группа представляла интактную клеточную культуру кератоцитов. На 3 и 7 сутки после внесения образцов формировали клеточную суспензию, по методике описанной выше, и производили подсчет клеток с дальнейшим анализом активации раннего апоптоза методом «ДНК-комет».

    Метод «ДНК-комет» позволяет определить повреждение ДНК и изучить репарацию на уровне одиночной клетки. Начальный этап включал в себя подготовку предметных стекол с нанесением слоя агарозы (Диаэм, Россия).

    Полученную суспензию центрифугировали (Termo fisher scientific, США) 1100 об/мин, 5 мин, осадок ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (Termo fisher scientific, США) (pH-7.4), забирали пробу объемом 10 мкл (концентрация клеток 1х104) и переносили в пробирки типа Эппендорф (Genn Follower, США) с 1% раствором легкоплавкой агарозы (Диаэм, Россия) объемом 75 мкл.

    Полученную суспензию помещали на предметные стекла (Termo fisher scientific, США) с агарозным покрытием и охлаждали в течение 10 мин при t+4 ОС. Далее переносили в лизирующий раствор (10мМ Триса (Диаэм, Россия), 2,5 М NaCl (Диаэм, Россия), 100мМ ЭДТА (Диаэм, Россия)), инкубация составила 1 час при t+4 ОС. Полученные препараты переносили в щелочной раствор (pH>13) (Termo fisher scientific, США) для проведения электрофореза 1В на 1 см, 20 мин, нейтрализацию проводили, используя фосфатно-солевой буфер (pH-7.4) (Termo fisher scientific, США). Для окрашивания использовали раствор этидиума бромида (Диаэм, Россия) в дистиллированной воде, экспозиция составила 2 часа при t+4 ОС, в темноте. В качестве положительного контроля была использована клеточная культура после воздействия UVоблучения (Biosan, Латвия) в течение 15 мин. Анализ препаратов проводили, используя лазерно-сканирующий конфокальный микроскоп Olympus FV 10i (Olympus, Япония).

    2.2.2. Экспериментально-морфологическое исследование влияния разработанных гелевых окрашенных имплантатов на роговицу человека (органотипическое культивирование in vitro)

    Исследования на модели органотипического культивирования были направлены на изучение особенности взаимодействия ткани роговицы человека с созданными гелевыми окрашенными имплантатами на основе различных материалов.

    Для эксперимента было использовано 12 роговиц, полученных из Глазного тканевого банка МНТК «Микрохирургии глаза» и не пригодных для трансплантации. Характеристики полученных роговиц: средний возраст донора 58 +/- 16 лет, 8 мужчин и 4 женщины, среднее время от момента смерти 18 +/- 5 часов, показатель трансплантабельности по С.А. Борзенку 2В. Во всех роговицах был сформирован интрастромальный туннель механическим способом с последующим введением в него образца гелевого имплантата, контрольную группу составили роговицы без введения имплантата.

    Распределение роговиц по группам представлено в таблице (Табл. 1)

    Метод органотипического культивирования роговиц

    Органотипическое культивирование роговиц в ходе исследования проводилось при стандартных условиях: t +37 оС, 5% CО2; (инкубатор NuAire, США), в питательной среде: DMEM/F12 (Sigma, США) c добавлением 2% эмбриональной бычей сыворотки (Thermo Fisher, США), 1% раствора антибиотиков (Thermo Fisher, США) и 1% раствора глутамакса (Thermo Fisher, США). Визуальный контроль осуществлялся при помощи инвертированного светового фазово-контрастного микроскопа Olympus IX- 81 (Olympus, Япония). Через 7 суток культивирования роговицы доставали из питательной среды и промывали 3-х кратно фосфатно-солевым буфером (ПанЭко, Россия) для дальнейшего исследования на апоптоз.

    Метод исследования раннего апоптоза

    Для определения токсичности изучаемых образцов определяли апоптоз кератоцитов в криостатных срезах роговицы. Для этого роговицу заливали гелем для заморозки (Thermo Fisher, США) и производили заморозку материала в течение 20 минут при -30 оС, с последующим проведением криостатных срезов с толщиной 5 мкм (рис. 2). Роговицу фиксировали горизонтально, срез проводился вертикально под углом 90о (65о угол отклонения столика, 25о угол кривизны лезвия, 10о отклонение приводящей головы). Полученные срезы приклеивали к полилизиновым стеклам (Thermo Fisher, США).

    Изучение апоптоза проводили методом иммуногистохимии. Срезы обрабатывали раствором Тритон X-100 (Thermo Fisher, США) в течение 10 минут. Для изучения каспазного пути апоптоза использовали первичные антитела к Caspasa 8 (Abcam, Великобритания), Caspasa 3/7 (Abcam, Великобритания), а для изучения митохондриального пути апоптоза – BAX (Abcam, Великобритания), Cyt C (Abcam, Великобритания), культивирование с антителами производили в течение 60 мин. при комнатной температуре. Далее 3-х кратно промывали срезы раствором фосфатно-солевого буфера (ПанЭко, Россия). Для детекции первичных антител использовали флуоресцентные краситель Alexa Fluor 488 (Ex. 495; Em. 519) (Abcam, Великобритания) и Alexa Fluor 594 (Ex. 590; Em. 617) (Abcam, Великобритания) культивирование производили в течение 60 мин., при комнатной температуре. Визуализацию клеточного ядра производили ядерным красителем Hoechst (Abcam, Великобритания). Для детекции антител использовали конфокальный сканирующий микроскоп Olympus IF-10i (Olympus, Япония).

    Анализ полученных снимков проводили с помощью программного обеспечения «Cell Profiler», которое позволяет выделять необходимые для анализа клеточные компоненты, а именно ядро, цитоплазму или клетку (ядро + цитоплазма), и рассчитать интенсивность свечения каждой клетки, используя встроенные инструменты программного обеспечения.

    Метод сканирующей электронной микроскопии

    В качестве фиксатора для роговиц использовался 10%-ый раствор формалина (ДиаЭм, Россия). Для проведения оптимальной дегидратации применялся раствор ацетона (ДиаЭм, Россия) в восходящих концентрациях: 10, 20, 30, 50, 70, 90, 100 х3 % по 30 минут в каждом с последующей вакуумной сушкой в критической точке. После сушки образцы монтировались на алюминиевом столике с помощью карбонового клея, напылялись золотом с толщиной слоя 5 нм для обеспечения электронно-проходящего слоя на поверхности образца. Далее образцы помещались в камеру сканирующего электронного микроскопа (Jeol, Япония) и исследовались в условиях высокого вакуума при ускоряющем напряжении 5 кВ.

    Обработка количественных данных

    Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием методов описательной статистики с определением средней арифметической величины (М) и стандартного отклонения (±σ) на персональном компьютере с программным обеспечением Graph Pad Software Prisma 8.