2.2. Метод электронной микроскопии

    Выбор метода исследования

    Традиционно используемые методы гистологических исследований с применением световой микроскопии не позволяют в должной мере исследовать микроструктуру ВПМ, сетчатки и витреоретинальных взаимоотношений. Разрешение световой микроскопии невелико и этот метод позволяет анализировать только плоскостные срезы исследуемых тканей. Исследование микроструктур с применением световой микроскопии неинформативно.

    Сканирующая электронная микроскопия позволяет получать изображение не только поверхности, но и структуру приповерхностных слоев. Сканирующий электронный микроскоп позволяет получать увеличение от 10 до 1 000 000 крат, что приблизительно в 500 раз превышает предел увеличения световых микроскопов. Сканирующие электронные микроскопы обладают чрезвычайно большой глубиной резкости (0,6-0,8 мм, т. е. 600-800 мкм), что на два порядка выше, чем у оптического микроскопа. Это дает возможность получать изображения с характерным трехмерным эффектом для объектов со сложным рельефом и высококачественное изображение с разрешением до 1 мкм [27].

    Перечисленные качества сканирующей электронной микроскопии делают ее чрезвычайно привлекательной и практически безальтернативной именно для микроструктурных исследований.

    Зрелые коллагеновые фибриллы являются наименьшей структурной единицей стекловидного тела. Их диаметр составляет порядка 20 нм (1/50 мкм). Диаметр фибрилл находится за пределами разрешающей способности сканирующего электронного микроскопа. Трансмиссионная электронная микроскопия позволяет получать изображение объектов с разрешением около 3 нм, что дает возможность исследовать объекты менее 1 мкм, в данном случае – отдельные коллагеновые фибриллы СТ человека.

    Подготовка препаратов для сканирующей электронной микроскопии

    Фиксация с заливкой в целлоидин. Подготовку препарата для исследования микроструктуры ВПМ производили следующим образом: глазное яблоко фиксировали в жидкости Сент-Джиордьи семь суток. Дофиксацию проводили в смеси из 100 мл фиксатора и 50 мл ацетона три дня. Затем материал проводили через ацетон, 100% спирт, спирт-эфир, и выполняли последующую заливку в целлоидин. Фиксацию материала и заливку в целлоидин проводили в лаборатории патологической анатомии и гистологии глаза ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» под руководством кандидата медицинских наук Шацких А.В. Для исследования ВПМ макулярной области сетчатки выполняли непрерывный срез в трансверсальной плоскости (параллельно плоскости центральной сетчатки). Следующим этапом целлоидин вымывали из препаратов эфиром.

    Предварительная заливка в целлоидин исключала деформацию препарата в процессе изготовления срезов. При вымывании из препарата целлоидина эфиром микроструктурные взаимоотношения сохранялись в неизменном виде. Таким образом исключалась деформация тканей препарата в процессе его приготовления. Следующим этапом изготавливали препараты макулярной области сетчатки для сканирующей электронной микроскопии.

    Подготовка препаратов с фиксацией в глютаровом альдегиде.

    Предварительно проводили отсепаровку передних отделов СТ от хрусталика с последующим удалением иридо-хрусталикового блока. Для выделения области, соответствующей центральным отделам сетчатки, выполняли 4 радиальных разреза склеры от лимбальной зоны до экватора без повреждения стекловидного тела с одновременной его отсепаровкой. Таким образом формировали четыре лепестка склеры, отсепарованной от СТ до экватора при сохранении целостности СТ. Следующим этапом иссекали сформированные лепестки склеры на уровне экватора. Из сформированного блока удаляли СТ и формировали препарат заднего полюса глаза с сохранением всех оболочек. Затем выполняли выкраивание препаратов центральной области сетчатки. В дальнейшем проводили анатомические и экспериментальные исследования на сформированном препарате.

    Фиксацию препарата выполняли с использованием глютаральдегида. Глютаральдегид позволяет сохранить ткань в нативном состоянии, максимально близком к прижизненному, без постфиксационной деформации. Проводили фиксацию препарата в смеси растворов глютарового альдегида и двукратного фосфатно-солевого буфера (дигидрофосфата калия KH2PO4) в соотношении глютаровый альдегид: буфер: дистиллированная вода – 8:25:25. Фиксировали препарат в течение 1 суток. После фиксации образцы отмывали в трех сменах дистиллированной воды с последующим обезвоживанием в спиртах восходящей концентрации: 30% этиловый спирт 15 мин, 50% этиловый спирт 15 мин, 70% этиловый спирт 15 мин, 96% этиловый спирт 15 мин, 100% этиловый спирт – 2 смены по 15 мин. После обезвоживания препарат помещали в промежуточную жидкость (ацетон) для последующей подготовки к сканирующей электронной микроскопии.

    Подготовка к сканированию и сканирующая электронная микроскопия

    Препараты, помещенные в промежуточную жидкость, переносили в барокамеру установки HitachiHCP-2 (Япония). В среде жидкой углекислоты производили высушивание препарата в критической точке. Высушенный препарат наклеивали на специальный токопроводящий предметный столик и помещали в ионно-распылительную установку Eiko IB-3 (Япония), где в атмосфере аргона на поверхность препарата напыляли золото-палладиевое покрытие толщиной 15 нм при режиме ионного тока 6 мА и межэлектродном напряжении 1,5 кВ.

    Сканирующую электронную микроскопию выполняли на сканирующем электронном микроскопое «Camscan-S2» (Cambridge Instruments, Великобритания) в режиме регистрации вторичных электронов при ускоряющем напряжении 20 кВ. Захват и обработку изображения проводили с использованием системы оцифровки изображений: плата АЦП LCard под управлением программы MicroCapture (ООО «СМА»). Морфометрию выполняли с использованием масштабного маркера, который изменяет свою длину в процессе компьютерного увеличения (Рисунки 2.1, 2.2).

    Исследования выполнены в Общефакультетской лаборатории электронной микроскопии ФГБОУ ВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова». Заведующий лабораторией Давидович Г.Н., ведущий инженер лаборатории электронной микроскопии Богданов А.Г.

    Подготовка препаратов стекловидного тела для трансмиссионной электронной микроскопии

    Предварительно проводили отсепаровку передних отделов СТ от хрусталика с последующим удалением иридо-хрусталикового блока. Разрезы выполняли без повреждения стекловидного тела с одновременной его отсепаровкой. Производили 4 радиальных разреза склеры донорского глаза от лимбальной зоны до экватора. Таким образом формировали четыре лепестка склеры, отсепарованной от СТ до экватора при сохранении целостности СТ. Переднее кортикальное СТ вскрывали ножницами, после чего СТ в центре захватывали пинцетом и производили иссечение каплевидной формации, размером 0,5 на 2 см. Полученный фрагмент СТ рассекали на две части. Одна часть использовалась в качестве контроля, вторая – для экспериментальных исследований.

    Фрагменты СТ фиксировали в смеси растворов глютарового альдегида и двукратного фосфатно-солевого буфера (дигидрофосфата калия KH2PO4) в соотношении глютаровый альдегид: буфер: дистиллированная вода как 8:25:25. Фиксировали препарат в течение 1 суток. Далее образцы отмывали раствором дигидрофосфата калия KH2PO4, после чего обрабатывали 1%-м раствором тетраоксида осмия OsO4. После фиксации образцы отмывали в трех сменах дистиллированной воды с последующим обезвоживанием в спиртах восходящей концентрации – 30% этиловый спирт 15 мин, 50% этиловый спирт 15 мин, 70% этиловый спирт 15 мин, 96% этиловый спирт 15 мин, 100% этиловый спирт – 2 смены по 15 мин. После обезвоживания образцы помещали в ацетон и выполняли постепенную пропитку образцов эпон-аралдитовой смесью, последовательно увеличивая содержание смолы относительно ацетона до замены чистой смолой. Далее образцы помещали в специальную заливочную форму и заливали чистой смолой. Через 12 часов образцы помещали в термостат при 60°С на двое суток. Полученный блок затачивали в форме четырехгранной пирамиды. Из полученного блока предварительно готовили полутонкие срезы, толщиной 0,5 мкм, которые анализировали на световом микроскопе для определения нужного участка для последующего изготовления ультратонких срезов, толщиной 50-60 нм. Срезы производили микротомом Ultracut-R (Leica Microsystems). Ультратонкие срезы наносили на сетки с формваровым покрытием и контрастировали 2%-м уранилацетатом и цитратом свинца.

    Трансмиссионную электронная микроскопию в режиме исследования объектов в проходящих электронных пучках выполняли на трансмиссионном электронном микроскопе «JEOL JEM-1011» (Япония). Ускоряющее напряжение 80 кВ. Захват и обработку изображения производили цифровой фотокамерой GATAN ES500W, работающей под управлением программы Digital Micrograph фирмы GATAN. Морфометрию выполняли с использованием масштабного маркера, который изменяет свою длину в процессе компьютерного увеличения.

    2.2.1. Микроструктурные исследования

    Метод изучения микроструктуры внутренней пограничной мембраны

    Задача исследования состояла в изучении микроструктуры ВПМ в аспекте противоречивых литературных данных для составления более точного представления о ее анатомии и получение исходной сравнительной информации об интактной ВПМ центральных отделов сетчатки для продолжения дальнейших исследований.

    Исследование ВПМ проводили на десяти донорских глазах от пяти доноров возраста 43-45 лет, с предварительной фиксацией в целлоидине. Исследовали толщину ВПМ в области центральной ямки, структуры поверхности ВПМ фовеолярной и макулярной области. Исследование проводили методом сканирующей электронной микроскопии.

    Метод изучения микроструктуры витреоретинальных взаимоотношений центральных отделов сетчатки

    Задача исследования состояла в изучении витреоретинальных взаимоотношений центральных отделов сетчатки в аспекте существующих анатомических представлений, тезисе о резидуальном СТ, концепции ВРА, теоретически возможного синтеза коллагена в СТ взрослого человека и получении исходной сравнительной микроструктурной картины для проведения дальнейших экспериментальных исследований.

    Изучение микроструктуры витреоретинальных взаимоотношений центральных отделов сетчатки проводили на шестнадцати донорских глазах от восьми доноров. Возраст доноров составил 45-50 лет. В процессе подготовки препарата предварительно отделяли СТ от поверхности сетчатки, после чего изготавливали препарат, включающий в себя центральные отделы сетчатки в пределах центральных сосудистых аркад. Выполняли фиксацию в глютаровом альдегиде, после чего его вымывали и производили дальнейшую подготовку прапарата к электронной микроскопии. Исследование проводили методом сканирующей электронной микроскопии.

    Метод изучения клеточной микроструктуры витреоретинального контакта

    Изучение клеточной микроструктуры витреоретинального контакта проводили на восемнадцати донорских глазах от девяти доноров. Возраст доноров – 30-40 лет. В процессе подготовки препарата предварительно отделяли СТ от поверхности сетчатки, после чего изготавливали препарат единым блоком, который включал в себя задний полюс глаза с центральными отделами сетчатки в пределах сосудистых аркад. Выполняли фиксацию в глютаровом альдегиде, после чего его вымывали и производили дальнейшую подготовку прапарата к электронной микроскопии. Исследование проводили методом сканирующей электронной микроскопии.

    Метод изучения витреоретинальной адгезии

    Изучение ВРА было производили на тех же восемнадцати донорских глазах от девяти доноров, на которых проводили исследование микроструктуры витреоретинального контакта. Возраст доноров 30-40 лет. Производили исследование микроструктуры СТ на препарате, изготовленном единым блоком, который включал в себя задний полюс глаза центральных отделов сетчатки в пределах сосудистых аркад. Фиксацию производили в глютаровом альдегиде. После вымывания глютарового алдегида изготавливали препарат для электронной микроскопии. Исследование проводили с использованием сканирующей электронной микроскопии.

    2.2.2. Экспериментальные методы

    Исследования воздействия коллагеназы на фибриллы стекловидного тела

    Исследования проводили на СТ от десяти донорских глаз пяти доноров возраста 40-42 лет. Исследовали эффекты воздействия препарата бактериальной коллагеназы «Коллализин», произведенного Санкт-Петербургским НИИ вакцин и сывороток.

    Выполняли препарирование и выделение СТ единым блоком. Из выделенного блока СТ иссекали фрагмент, объемом около 1 мл. Иссеченный фрагмент СТ разделяли на две, примерно равные части. Один из фрагментов фиксировали в растворе глютаральдегида для использования в качестве контроля, второй фрагмент СТ помещали в предварительно приготовленный раствор коллагеназы. Коллагеназу растворяли в физиологическом растворе, предварительно подогретом до 36ºС, концентрация коллагеназы составила 300 КЕ на 1 мл, объем раствора 10 мл. Фрагмент СТ, находящийся в растворе коллагеназы, помещали на 1 час в термостат при температуре 36ºС. Далее фрагмент СТ извлекали, фиксировали в растворе глютаральдегида. Выполняли дальнейшую обработку препарата для подготовки к исследованию. Исследование проводили методом трансмиссионной электронной микроскопии.

    Исследование воздействия коллагеназы на эпиретинальное стекловидное тело

    Исследование воздействия бактериальной коллагеназы на эпиретинальное СТ проводили на 16 донорских глазах от 8 доноров возраста 40-42 лет. Предварительно отделяли СТ единым блоком от сетчатки и выполняли последующую круговую резекцию заднего полюса глаза с формированием препарата, включающего область диска зрительного нерва, макулярную и парамакулярную область. Один из приготовленных препаратов использовали в качестве контроля, препарат, изготовленный из парного глаза, подвергали воздействию коллагеназы. Приготовленный блок погружали в раствор коллагеназы при температуре 36ºС, содержащий 100 КЕ коллагеназы на 1 мл и помещали в термостат с температурой 36ºС на 1 час. Контрольный препарат погружали в сбаланситрованный солевой раствор и также помещали в термостат с температурой 36ºС на 1 час. Контрольный и исследуемый препараты фиксировали в растворе глютаральдегида, после чего выполняли их подготовку для дальнейшего исследования. Исследование микроструктурных изменений проводили методом сканирующую электронную микроскопию.

    Определение начальной пороговой дозы коллагеназы и исследование динамики эффекта воздействия в зависимости от дозы препарата

    Исследование проводили на тридцати глазах от пятнадцати доноров возраста 40-45 лет. Предварительно выделяли СТ единым блоком и производили последующую круговую резекцию заднего полюса и формировали препарат, включающий область диска зрительного нерва, макулярную и парамакулярную область. Один из приготовленных препаратов оставляли в качестве контроля, препарат из парного глаза подвергали воздействию коллагеназы. Препараты помещали в растворы коллагеназы с постепенным увеличением доза от 1 КЕ на 1 мл до 30 КЕ на 1 мл с экспозицией в 20 минут при температуре 36ºС. По окончании экспозиции фиксировали препараты в растворе глютаральдегида, после чего проводили его вымывание и высушивали препарат для последующей подготовки к электронной микроскопии. Исследование проводили с применением сканирующей электронной микроскопии.

    Исследование воздействия коллагеназы на интраретинальные структуры

    Исследование проводили на восемнадцати донорских глазах от девяти доноров возраста 40-45 лет, по два парных глаза на каждую дозу и время экспозиции, один глаз использовли в качестве контроля. Исследовали воздействие коллагеназы в концентрации 30 КЕ на 1 мл с экспозицией в 24 часа при температуре 36ºС. Предварительно удаляли основной объем СТ, в витреальную полость исследуемого глаза вводили раствор коллагеназы, в витреальную полость контрольного глаза – сбалансированный физиологический раствор, после чего исследуемые препараты помещали в термостат при температуре 36ºC. После необходимой экспозиции препараты фиксировали в растворе глютаральдегида, затем проводили последующую подготовку для дальнейшего исследования. После высушивания препарата производили его дополнительное препарирование. Препарат разделяли на фрагменты: фрагмент с частично отделенной с поверхности сетчатки ВПМ (для исследования состояния слоя нервных волокон), фрагмент сетчатки, отделенной от пигментного листка (для исследования сетчатки со стороны палочек и колбочек), фрагмент с ретинальным пигментным эпителием.

    Исследование проводили методом сканирующей электронной микроскопии.

    Исследование цитотоксичности коллагеназы в расширенном диапазоне дозы и экспозиции в аспекте интравитреального применения

    Проведено изучение цитотоксичности препарата «Коллализин» производства Санкт-Петербургского НИИ вакцин и сывороток в возрастающих дозах с различной экспозицией. Исследование произведено на культуре фибробластов мыши линии NIH 3Т3 для определения отношений «доза-реакция». Работа выполнена на базе Института медико-биологических исследований и технологий (АНО «ИМБИИТ»). За основу были взяты рекомендации международного стандарта ГОСТ РИСО 10993.5-99. Часть 5. «Исследование на цитотоксичность: методы in vitro», который является обязательным в исследовании цитотоксичности медицинских изделий. Культура фибробластов мыши линии NIH 3Т3 признана стандартной для такого рода исследований. Исследованиям на цитотоксичность подвергали раствор препарата «Коллализин» в концентрациях: 5 КЕ/100 мкл, 15 КЕ/100 мкл, 30 КЕ/100 мкл, 40 КЕ/100 мкл, 60 КЕ/100 мкл, 80 КЕ/100 мкл, 120 КЕ/100 мкл с возрастающим временем экспозиции 10, 20, 30 мин, 1, 3, 24 часа.

    Схема эксперимента. Клетки высевали в культуральные плоскодонные 96-луночные планшеты и инкубировали 24 ч во влажной атмосфере, содержащей 5±1% СО2 до образования 80±10% монослоя, затем вносили в культуру исследуемый препарат в различных концентрациях. На каждую концентрацию – не менее 3 лунок. Морфологию и лизис клеток оценивали через 5, 10, 30 мин, 1, 3 и 24 ч инкубации при температуре 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5±1% СО2. Отрицательным контролем служила среда F-12 без сыворотки, положительным – раствор цинка в азотной кислоте (Zn 1-2 wt.% HNO3, разбавление 1:100 физиологическим раствором). Различные дозы препарата «Коллализин» были промаркированы. Маркировка представлена в Таблице 2.1.

    Подготовка клеток

    Клетки удаляли из культурального флакона методом трипсинизации, ресуспендировали культуральной средой, содержащей сыворотку. Готовили суспензию клеток с необходимой концентрацией 1-2х105 (или 10 5 ) кл/мл. Определение количества клеток в суспензии проводили с использованием гемоцитометра (камеры Горяева). Клетки высевали в культуральные 96-луночные плоскодонные планшеты, добавляя по 100 мкл суспензии необходимой концентрации в каждую лунку. Планшеты инкубировали 24 ч при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5±1% СО2, до образования клетками 80±10% монослоя. Уровень конфлюэнтности монослоя оценивали с помощью бинокулярного инвертированного микроскопа Биолам П-I (Россия) при увеличении х100.

    Через 24 ч в лунки вносили испытываемые препараты в необходимых концентрациях в объеме 100 мкл/лунку. Планшеты инкубировали 5, 10, 30 мин, 1, 3, 24 ч при температуре 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5±1% СО2. Через 5, 10, 30 мин, 1, 3, 24 ч инкубации из планшета с препаратом удаляли содержимое и промывали фосфатным буфером. В каждую лунку добавляли 0,1% раствор витального красителя трипанового синего на фосфатном буфере. Через 1-2 мин краситель удаляли из лунок, аккуратно промывали лунки фосфатным буфером, после чего сразу же производили оценку культуры микроскопически на наличие морфологических изменений и/или уменьшение плотности клеток. Трипановый синий окрашивает лизированные клетки и/или клетки с поврежденными клеточными мембранами.