2.2 Методы экспериментальных исследований консервации донорских роговиц и питательных сред

    Исследование водородного показателя pH консервационных сред

     Для определения водородного показателя pH в консервационных средах был использован микропроцессорный pH метр с термометром (HANNA, Португалия). Калибровку прибора осуществляли при комнатной температуре +25 °С, специализированными растворами с известными показателями pH = 4; 7; 10.

    Для исследования водородного показателя в консервационных средах опытной и контрольной группах, были отобраны аликвоты сред в объёме 10 мл. Далее аликвоты нагревали до комнатных температур +25 °С, путем не прямого нагрева флакона на водяной бане. После стабилизации температуры, образцы помещали в емкость объёмом 10 мл. с широким горлышком для погружения pH и термо- электродов. Каждый образец исследовали пятикратно с дальнейшим усреднением полученных показателей. После каждого измерения электроды доставили и 3-х кратно промывали 10 мл. mQ водой (18,2 MΩ/cm; +25 °С; очищенной через 0,22 µm мембранный фильтр)

    Исследование осмотического давления консервационных сред

    Под осмолярностью понимают количество частиц в 1 кг воды (моляльность раствора — это число молей в 1 л воды). Осмотическая активность (молярность) является важной характеристикой водного пространства. Осмолярность определяет обмен жидкости между сосудом и тканью, поэтому ее изменения могут существенно сказываться на интенсивности обмена воды и ионов и нарушениях их обмена. Молярная концентрация плазмы колеблется в пределах от 295 до 310 ммоль/л.

    Онкотическое или коллоидно-осмотическое давление крови обусловлено белками, а сред для консервации роговиц – крупномолекулярными полисахаридами (декстранами), составляет в среднем 25 мм.рт.ст. и входит составляющей в общую осмолярность плазмы и растворов или осмотическую активность.

    Осмолярность плазмы составляют Na+ и анионы (88%), остальные 12% — глюкоза, мочевина, К+, Mg++, Са++, белки. Осмотическую активность мочи определяют мочевина (53%), анионы (30%), Na+ (9%), остальные 8% приходятся на К+, NH4+, Са++. Осмотическую активность определяют с помощью осмометра, принцип работы которого основан на определении криоскопической константы данного раствора и сравнении ее с криоскопической константой воды. Исследование онкотической активности консервационных сред проводилось с помощью медицинского осмометра ОСКР-1М (рис. 1) методом криоскопии общей концентрации осмотически активных веществ (осмоляльности). Прибор прост в калибровке, автоматически запоминает калибровочные значения, не требует каких-либо регулировок. Процесс измерения полностью автоматизирован, что освобождает оператора от постоянного наблюдения за работой прибора, за исключением необходимости правильной подготовки образца для каждого измерения. Автоматическая калибровка и измерение исключает субъективность в интерпретации результата. Использовалась возможность проведения измерения осмоляльности в микрообъемах плазмы именно данной модели прибора.

    Для исследования отбирались аликвоты сред в объеме по 100 мкл из 20-ти миллилитровых флаконов нескольких партий выпуска. При этом диапазон измерения концентрации равнялся 0...2000 ммоль/кг Н₂O; пределы допускаемой основной абсолютной погрешности при измерении концентрации от 0 до 500 ммоль/кг Н2О составляли ± 2 ммоль/кг Н₂О.

    Исследование динамики гидратации и жизнеспособности клеток роговицы после консервации в среде собственной рецептуры

    Использовали жизнеспособные трупные роговицы человека, полученные из Глазного тканевого банка ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России, в количестве 16 от 8 доноров. Одна роговица от каждого донора являлась контрольной, другая, парная, служила опытным образцом. Роговицы, составляющие контрольную группу, помещали во флаконы с раствором Борзенка-Мороз для консервации роговицы. Роговицы, входящие в опытную группу, консервировали во флаконах в среде собственной рецептуры, которое, за счет входящих в его состав фармакологических компонентов, обладает мембраностабилизирующим и мембрано-восстанавливающим действием.

    Для подтверждения функциональных свойств консервационной среды проводили изучение уровня гидратации стромы консервированных донорских роговиц опытной (n = 8) и контрольной групп (n = 8) методом точного взвешивания на аналитических весах (Sartorius BP 210S, Германия) и пахиметрии с помощью оптического когерентного томографа (Optovue, iVue 100, США) на 0, 1-е, 2-е, 3-и и 4-е сутки исследования.

    На основании полученных данных определяли срок консервации, при котором достигается оптимальная дегидратация донорских роговиц без потери жизнеспособности.