2.2. Методы исследования

    Клинические методы исследования включали изучение анамнеза и офтальмологическое обследование: визометрия, тонометрия, биомикроскопия, офтальмоскопия в прямом и обратном виде, эхо-офтальмография, УЗИ глаза, обзорная рентгенография орбит и рентгенография по Комбергу – Балтину для локализации инородных тел.

    Объектом исследований служили влага передней камеры и периферическая кровь из локтевой вены, которые забирались во время операции (ПХО, ФЭК) в стерильные пробирки Vaсuette c EDTA. Исследовали уровни интерлейкинов-IL-1β, IL-4, IL-6, IFN-α, TNF-α, а также содержание вируса простого герпеса и цитомегаловируса методом ПЦР.

    Метод забора периферической крови у пациентов с проникающим ранением роговицы глаза и с пресенильной катарактой

    Забор крови из локтевой вены в объеме 5 мл проводился в условиях операционной, непосредственно перед хирургическими вмешательствами. Кровь доставлялась в лабораторию в первые сутки и после обработки хранилась при температуре -80°С в специальных пробирках.

    Исследование цитокинов в крови и во влаге передней камеры глаза

    Концентрации IL-1β, IL-1Ra, IL-4, IL-6, TNF-α и INF-α в крови и во влаге ПКГ исследовали методом иммуноферментного анализа (ИФА) на коммерческих наборах ООО «Цитокин» (г. Санкт-Петербург) и eBioscience (USA).

    Исследование уровня вышеперечисленных интерлейкинов, фактора некроза опухоли – альфа и интерферона альфа в сыворотке периферической крови выполняли согласно прилагаемым инструкциям к коммерческим наборам ООО «Цитокин» (г. Cанкт-Петербург) без модификаций.

    ИФА каждого из вышеперечисленных цитокинов из влаги передней камеры глаза проводили на наборах eBioscience (platinum ELISA) в модификации. Основой модификации было первичное разведение влаги передней камеры глаза в буфере для разведения образцов коммерческого набора eBioscience (platinum ELISA). Исходя их того, что объем влаги ПКГ не превышал 120 мкл, для определения концентрации одного цитокина использовали 10 мкл влаги ПКГ и 40 мкл буфера для разведения образцов (разведение 1:5). В лунку вносили 50 мкл разведенного образца влаги ПКГ, что соответствует рекомендациям к ИФА наборам eBioscience (platinum ELISA, USA). Первичное разведение учитывали при снятии результатов ИФА влаги ПКГ. Общий объем затраченной влаги ПКГ для исследования шести цитокинов составлял 60 мкл.

    ПЦР-диагностика на наличие во влаге передней камеры глаза геномов вируса простого герпеса 1-го и 2-го типов (ВПГ), а также цитомегаловируса (ЦМВ) проведена всем пациентам основной и контрольной групп. ПЦР проводилась на коммерческих наборах НПФ «ДНК-диагностика» (г. Москва) согласно прилагаемым инструкциям. Выделение ДНК проводили из остаточного объема влаги ПКГ (30–50 мкл), который дополнительно центрифугировали (центрифуга eppendorf MiniSpin, USA) на 12000 оборотах в минуту в течение 5 минут для осаждения клеточных элементов влаги ПКГ. Выделение ДНК проводили из 30–50 мкл влаги ПКГ с осажденными на дно пробирки клеточными элементами с помощью коммерческих наборов «Проба-НК» НПФ «ДНК-диагностика» (г. Москва) по прилагаемым инструкциям.

    Общий объем влаги ПКГ, затраченной на исследования цитокинов и ПЦР, не превышал 100–120 мкл.

    Исследование концентрации цитокинов и ПЦР-диагностика выполнены на базе ООО «Современные медицинские технологии» (главный врач – д-р мед. наук, доцент Елена Викторовна Шабалдина).

    Исследование СРБ и ЦИК в периферической крови

    В периферической крови определяли 2 системных иммуновоспалительных маркера СРБ (С-реактивный белок) и ЦИК (циркулирующие иммунные комплексы). Определение концентрации СРБ в сыворотке крови проводили с помощью ИФА на наборах СРБ-ИФА-Бест (ООО «Вектор-Бест», г. Новосибирск) согласно прилагаемым инструкциям. Для определения ЦИК в сыворотке крови человека использовали турбидиметрический метод и набор реагентов «ЦИК-ХЕМА» (ООО «Хема-Медика», г. Москва), предназначенный для определения циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови человека. Эти исследования, как и общий анализ крови, выполнялись на базе клинической лаборатории КОКОБ.