2.2 Методы культивирования и исследования ретинального пигментного эпителия in vitro

    2.2.1 Выделение кроличьего ретинального пигментного эпителия, особенности культивирования

     Для выделения РПЭ было использовано 20 глазных яблок от 10 доноров-кроликов, энуклеированных и помещенных в условия гипотермии в течение 4 часов. Использовалась частично модифицированная техника препарирования, предложенная Борзенком С.А. и Поповым И.А. с соавторами (патент РФ на изобретение № 2569481 от 25.12.2014 «Способ получения культуры клеток ретинального пигментного эпителия из глаза взрослого донора-трупа»). Манипуляции с донорскими глазными яблоками и первичное выделение клеточного и тканевого материала проводились в ламинарном боксе Fotron LF (Pokrok výrobné druzstvo Zilina, Чехия).

    Описание техники выделения РПЭ

    Вакуумным трепаном диаметром 7,0 мм (Moria, Франция) выкраивали корнео-склеральный диск и удаляли из операционного поля. Далее рассекали склеру тремя меридиональными разрезами спереди назад длиной 2/3 от длины глазного яблока, параллельными переднезадней оси глаза через равные промежутки с получением трех лепестков склеры. Лепестки склеры поочередно отгибали и со стороны супрахориоидеи пересекали вортикозные вены и внутрисклеральную часть зрительного нерва. Затем склеру удаляли из операционного поля. Далее наносили три разреза на ХПК – первый круговой разрез – на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный разрез – в любом меридиане в направлении от первого разреза спереди назад к культе ДЗН, и второй круговой разрез – на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва. Далее ХПК аккуратно отделяли от нейросенсорной сетчатки пинцетом и укладывали на дно стерильной чашки Петри в положении «клетками РПЭ вверх», заливали 2 мл смеси раствора 0,25% трипсина-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и раствора Версена в соотношении 1:1 по объему, инкубировали в стандартных условиях (37°С, 5% CO₂) в течение 20 минут. В данной работе все этапы инкубирования 2D и 3D клеточных культур проводили в инкубаторе NU-5510 (NuAire, США). По окончании инкубации в чашку Петри для нейтрализации ферментативной смеси добавляли 1 мл эмбриональной телячей сыворотки (англ. fetal bovine serum, FBS) и отделяли клетки РПЭ от мембраны Бруха гидродинамически многократным промыванием струей стерильного фосфатно-солевого буфера (англ. phosphate buffered saline, PBS) под напором из шприца. Полученную суспензию клеток РПЭ переносили в центрифужную пробирку 10 мл. Далее суспензию клеток РПЭ объемом 200 мкл переносили в чашку Петри (35 мл) и исследовали с помощью инвертированного светового фазово-контрастного микроскопа IX81 с интегрированной цифровой фотокамерой XC10 (Olympus, Япония) при увеличении х100 – качественно оценивали степень чистоты суспензии клеток. IX81с интегрированной цифровой фотокамерой XC10 (Olympus, Япония)

    Протокол и особенности культивирования РПЭ

    Для 3D культивирования клеток традиционно первым этапом проводится 2D культивирование, что способствует получению достаточного количества клеточного материала, а также позволяет оценить свойства, жизнеспособность и фенотип полученных культур. В данной работе все манипуляции с 2D и 3D клеточными культурами проводили в ламинарном боксе II класса безопасности MSC-Advantage (Scientific Technologies, Германия).

    Для 2D культивирования использовали 20 суспензий клеток РПЭ, полученных от 10 доноров. Каждую полученную суспензию центрифугировали в режиме 1100 об./мин. в течение 5 минут (центрифуга SL-40 R, Thermo Scientific, Германия). Затем удаляли надосадочную жидкость и полученный осадок разбавляли 5 мл питательной среды. Полученные 2D культуры разделяли на 2 равные группы – опытную и контрольную [15], в зависимости от процентного содержания в объеме питательной среды факторов роста клеток, с целью определения возможности ускорения митоза клеток РПЭ.

    Состав питательной среды:

    1. Эмбриональная телячья сыворотка (англ. fetal bovine serum, FBS, HyClone, США) – естественный источник фактора роста и адгезии клеток – 20% (1-я группа – опытная) и 10% (2-я группа – контрольная) объема. По данным литературы, повышенное содержание FBS в питательной среде способствует клеточной пролифераци и не препятствует митозу, однако может способствовать трансформации эпителиальных клеток в мезенхимальные [98].

    2. Ростовая среда Игла в модификации Дульбекко и среды Хэма (DMEM/F12, Sigma, США) в соотношении 1:1 по объему – 78% (1-я группа – опытная) и 88% (2-я группа – контрольная) объема. Применяется для выращивания широкого спектра клеточных культур. Содержит витамины, соли и аминокислоты.

    3. Глутамакс (Gibco, США) – биологическая добавка для нормализации обмена веществ – 1% объема. Уменьшает цитотоксическое действие лимфоцитов и обладает антиоксидантным действием. Содержит витамины, аминокислоты и микроэлементы.

    4. Раствор антибиотиков: пенициллин, стрептомицин – аминогликозид, амфотерицин В – противогрибковый (ПанЭко, Россия) – 1% объема.

     Далее осуществляли забор 10 мкл жидкости с культурой РПЭ и проводили подсчет клеток при помощи автоматического счетчика клеток Luna II (Logos biosystems, Корея).

    Затем суспензии клеток РПЭ, находящиеся в питательной среде, переносили из пробирок в культуральные матрасы с площадью ростовой поверхности 25 см² (Techno Plastic Products, Швейцария) и инкубировали при стандартных условиях. Первую смену питательной среды проводили спустя 5-7 дней (в зависимости от адгезии большего количества клеток), далее – каждые 2-3 дня. Таким образом, получали первичную клеточную культуру, т.е. нулевого пассажа – Р0.

    По достижению 80%-й конфлуэнтности клеточного слоя в каждом культуральном матрасе 1-й и 2-й групп питательную среду аспирировали и клетки РПЭ ферментативно дезагрегировали раствором 0,25% трипсина-ЭДТА в течение 5 минут. Далее к суспензии клеток добавляли 1 мл питательной среды, клетки переносили в пробирку объемом 10 мл и центрифугировали в течение 5 минут (1100 об./мин.). Затем из пробирки удаляли надосадочную жидкость, клетки разбавляли 3 мл питательной среды. Полученную смесь рассаживали на 3 культуральных матраса, в каждый матрас добавляли 4 мл питательной среды, таким образом получали культуру клеток РПЭ 1-го пассажа – Р1.

    Полученные культуры использовали для проведения иммуноцитохимического исследования с последующим трехмерным клеточным культивированием. Также для оценки качественных и количественных характеристик 2D культур РПЭ опытной и контрольной групп проводили фоторегистрацию и подсчет клеток.

    2.2.2 Иммуноцитохимическое исследование 2D культур ретинального пигментного эпителия

     Для молекулярной идентификации клетки 2D культур пассажа P1 1-й опытной и 2-й контрольной групп подвергали иммуноцитохимическому исследованию для выявления ряда специфических белковых маркеров: RPE-65 – высокоспецифичный фермент пигментного эпителия сетчатки, один из ключевых белков зрительного цикла. Преимущественно располагается в мембране гладкого эндоплазматического ретикулума. ZO-1 (лат. zonula occludens) – это семейство белков, входящих в состав плотных запирающих межклеточных контактов в составе которых мембраны соседних клеток максимально сближены и «сшиты» специализированными белками. Роль плотных контактов заключается в том, чтобы ограничивать и регулировать параклеточную диффузию – они предотвращают протекание тканевой жидкости через эпителий, но при необходимости могут быть проницаемыми для ионов, небольших гидрофильных молекул и даже макромолекул. Всего в состав плотных контактов входит около 40 различных белков, как мембранных, так и цитоплазматических. Наиболее изученным является белок ZO-1. ZO-1 – типичный белок для клеток РПЭ.

    Цитокератины – это белки промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток. В настоящее время выявлено 20 типов цитокератинов.

    Спектр цитокератинов в эпителиальных клетках зависит от типа дифференцировки и положения клетки в эпителиальном пласте. В клетках простого однослойного эпителия экспрессируется цитокератин 8 и цитокератин 18.

    Виментин – белок промежуточных филаментов III типа, основной компонент мезенхимальных клеток. Увеличение экспрессии Виментина является признаком ЭМТ в клеточной культуре.

    Методика проведения иммуноцитохимического исследования

    После ферментативного дезагрегирования клетки РПЭ Р1 переносили на адгезивные стекла в расчете 10 тыс. клеток на одно стекло и культивировали при стандартных инкубационных условиях в течение 3 дней до 80% конфлуэнтности. Далее клетки 3 раза отмывали в растворе PBS, фиксировали в 4% растворе формалина в течение 20 минут при t=4°C и вновь 3-х кратно отмывали в PBS. Фиксированные клетки 2D культуры РПЭ инкубировали с первичными моноклональными антителами в соответствующих разведениях при комнатной температуре в течение 1 часа.

    Далее клетки 3-х кратно отмывали в PBS и наносили видоспецифичные вторичные антитела, конъюгированные с флуорохромами AlexaFluor 488 и 594 в разведении 1:250 (Abcam, Великобритания), после чего инкубировали 1 час при комнатной температуре. Затем стекла с клетками трижды отмывали в PBS, ядра докрашивали флуоресцентным красителем бис-бензимид – Hoechst 33258 (ПанЭко, Россия). Полученные препараты заключали под покровное стекло и анализировали в видимом и ультрафиолетовом световых диапазонах под лазерным конфокальным сканирующим микроскопом «Fluoview FV10I» (Olympus, Япония).

    2.2.3 Подготовка ретинального пигментного эпителия к трансплантации методом трехмерного клеточного культивирования

     Из полученной и охарактеризованной 2D культуры клеток РПЭ создавали 3D клеточные сфероиды. В данной работе использовали метод получения сфероидов РПЭ посредством неадгезивных 81-луночных планшетов (3D Petri Dishes, Microtissue, США), отличающийся от других наибольшей простотой и воспроизводимостью. Данный метод позволяет получать сфероиды в каждой лунке планшета из заданного количества клеток и способствует образованию плотных межклеточных связей между клетками в сфероиде.

    Клеточные 2D культуры Р1 с конфлуэнтным монослоем переводили в 3D культуру. В данной работе для создания 3D сфероидов использовали клетки РПЭ 1-го пассажа, так как по данным литературы по мере увеличения пассирования в культуре может увеличиваться преобладание клеток мезенхимального фенотипа [15].

    Методика конструирования 3D клеточных сфероидов РПЭ

    Питательную среда 2D культур аспирировали из культуральных матрасов и клетки РПЭ ферментативно дезагрегировали 1 мл раствора трипсина-ЭДТА 0,25% в течение 5 минут при стандартных инкубационных условиях. Далее к суспензии клеток добавляли 1 мл питательной среды, клетки переносили в пробирку объемом 10 мл и центрифугировали в течение 5 минут (1100 об./мин.). Затем надосадочную жидкость удаляли и к суспензии клеток РПЭ добавляли 1 мл питательной среды стандартного состава. Образец суспензии объемом 5 мкл использовали для подсчета клеток с помощью автоматического счетчика клеток. Затем клетки РПЭ, находящиеся в питательной среде, переносили в агарозные планшеты из расчета 81000 клеток на 1 планшет. Таким образом, формировали сфероиды, каждый из которых содержал 1000 клеток. Количество клеток в сфероиде обусловлено данными, полученными авторами в предыдущих исследованиях – сфероиды, состоящие из 1000 клеток быстрее адгезируются к плоской поверхности и имеют диаметр около 100 мкм, что необходимо для того, чтобы субретинально инъецировать клеточные трансплантаты через канюли минимального диаметра. Также, такая концентрация клеток является оптимальной для свободной диффузии питательных веществ в 3D культуре и позволяет избежать центрального некроза, характерного при формировании более крупных сфероидов. Меньшее количество клеток в сфероиде нежелательно ввиду риска недостаточного терапевтического эффекта [15, 19].

    2.2.4 Оценка морфо-функциональных характеристик 3D сфероидов ретинального пигментного эпителия

     За динамикой формирования сфероидов внутри лунок агарозного планшета следили ежедневно в течение 30-и дней, также проводили фоторегистрацию полученных клеточных культур и давали качественную оценку наблюдаемым явлениям. Кроме того, на указанных сроках фиксировали изменение диаметра формирующихся микроагрегатов.

    После переноса суспензии клеток РПЭ в агарозные планшеты клеточные культуры фотографировали через 3 часа, на 1-й день и ежедневно в течение 30 дней с помощью инвертированного светового фазово-контрастного микроскопа. Также, с 1-го по 30-й день ежедневно проводили измерение диаметра сфероидов и оценивали их форму. Смену питательной среды проводили каждые 2-3 дня.

    3D сфероиды РПЭ 4-х, 7-и и 11-и суток культивирования переносили из агарозных планшетов на чашки Петри (35 мм) и заливали 2 мл питательной среды. На данном этапе оценивали адгезивные свойства клеточных трансплантатов и их способность с спредингу.

    Полученные 3D сфероиды РПЭ также подвергались иммуноцитохимическому анализу и тестам на жизнеспособность, в том числе и после краткосрочной гипотермической консервации.

    Для определения клеточного фенотипа 3D сфероидов РПЭ проводили иммуноцитохимическое исследование на 4-е, 7-е и 11-е сутки культивирования. Для этого отдельно формировали сфероиды в количестве 600-700 штук.

    Полученные сфероиды 3-х кратно отмывали в растворе PBS, после чего производили фиксацию в 4%-м растворе параформальдегида в течение 20-ти мин при 4°С, затем вновь трижды отмывали в PBS. Фиксированные клетки 3D культуры инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с первичными антителами к маркерам RPE-65 (1:100), ZO-1 (1:100), цитокератину 8,18 (1:100) и виментину (1:250) с вторичными антителами, конъюгированными с флуорохромами AlexaFluor 488, 594 в разведении 1:250. Полученные сфероиды переносили в специально предназначенную чашку Петри с округлым углублением в центре и анализировали в видимом и ультрафиолетовом световых диапазонах под конфокальным лазерным сканирующим микроскопом. Преимуществом данного метода микроскопии является возможность получения изображения с очень тонкого слоя объекта, т.е. «оптического среза» (slice). На основе серии оптических срезов проводили объемную реконструкцию объекта и получали его трехмерное изображение, не используя при этом трудоемкую методику изготовления и фотографирования серийных гистологических срезов.

    Для оценки жизнеспособности полученных клеточных культур на аналогичных сроках наблюдения использовали флуоресцентный краситель «Live and Dead» (Abcam, Великобритания). Данный краситель представляет собой коммерческий набор, содержащий в своем составе два флуоресцентных красителя – живые клетки окрашиваются в зеленый цвет, мертвые клетки окрашиваются в красный цвет. В данном исследовании использовали клеточные культуры 4-х, 7-х и 11-х суток культивирования. Полученные трансплантаты помещали в пробирки, центрифугировали (1100 об./мин., 5 мин), удаляли надосадочную жидкость и добавляли 1 мл раствора PBS. Далее повторно центрифугировали (1100 об./мин., 5 мин), полученный осадок ресуспензировали в 100 мкл раствора PBS с 1х концентрацией раствора «Live and Dead» и инкубировали при комнатной температуре 10 минут в темноте. Анализ осуществляли с помощью лазерного конфокального сканирующего микроскопа. Кроме того, в связи с необходимостью транспортировки сконструированных клеточных трансплантатов из культуральных лабораторий в операционные блоки, в данном случае из Головной организации ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России в Калужский филиал, 3D сфероиды РПЭ исследовали на выживаемость после краткосрочной гипотермической консервации (разд. 3.6).

    Также на данном этапе изучали адгезивные способности сфероидов и их способность к спредингу после нормотермического культивирования и после краткосрочной гипотермической консервации. Для этого трехмерные клеточные культуры 4-х, 7-х и 11-х суток культивирования переносили из агарозных планшетов на культуральные матрасы и заливали 5 мл питательной среды. Сфероиды ежедневно оценивали с помощью инвертированного светового фазово-контрастного микроскопа в течение 14 дней, а также измеряли площадь слоя РПЭ, образуемого в процессе спрединга.

    2.2.5 Сканирующая электронная микроскопия

     3D сфероиды РПЭ (4-е, 7-е и 11-е сутки культивирования) после краткосрочной гипотермической консервации (1-я опытная группа, n=40) и нормотермического культивирования (2-я контрольная группа, n=40) оценивали с помощью СЭМ (сканирующий электронный микроскоп 6000plus, Jeol, Япония) с целью определения формы и диаметра, согласно Протоколу сканирующего электронно-микроскопического исследования:

    1. Фиксирование 3D сфероидов РПЭ в 10% р-ре формалина в течение 1 часа при t=+4° С.

    2. Осаждение клеточных культур центрифугированием, удаление надосадочной жидкости.

    3. Трехкратное промывание трансплантатов в 100 мкл р-ра PBS в течение 5 мин.

    4. Обезвоживание 3D сфероидов РПЭ в ацетоне восходящей концентрации: 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 90% и 100% (трехкратно). В каждом из растворов объекты выдерживали по 15 минут и далее центрифугировали с последующей сушкой в критической точке (Critical Point Dryer Qurum k850, Quorum Technologies, Великобритания).

    5. Механическая фиксация 3D клеточных культур к предметному столику с помощью карбонового скотча.

    6. Напыление золотом (проба 999, толщина слоя 5 нм) в вакуумной напылительной установке для обеспечения электронно-проводящего слоя на поверхности образцов (Smart Coater SPI, SPI Supplies, США).

    7. СЭМ 3D сфероидов РПЭ при увеличении х1000 (мощность 10 kV).

    8. Фоторегистрация полученных изображений 3D клеточных культур с последующей оценкой морфологических особенностей.

    2.2.6 Гистологическое исследование

    Животные выводились из эксперимента на 1, 3, 7, 10, 14, 20, 30, 60 и 90-е сутки после оперативного вмешательства под общим наркозом путем воздушной эмболии с соблюдением правил биоэтики, утвержденных приказом МЗ СССР № 755 от 12.08.1997, а также принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского общества (86/609/ЕЕС) и Хельсинской декларации о защите позвоночных животных, используемых для лабораторных и иных целей. Глазные яблоки энуклеировались для последующих гистологических исследований.

    Методика получения гистологических препаратов

    После энуклеации глазные яблоки кроликов промывали проточной водой и фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, предварительно вводя интравитреально через pars plana 5% раствор формалина до достижения офтальмогипертензии. Энуклеированные глазные яблоки подвергали стандартной обработке с обезвоживанием и обезжириванием в спиртах восходящей концентрации (70°, 80°, 90°,96°, 100°) и заливали в парафин. Далее выполняли серии гистологических срезов с применением окраски гематоксилин-эозином. Препараты изучали с помощью инвертированного светового фазово-контрастного микроскопа с интегрированной цифровой фотокамерой при х50, х100, х200, х400 - кратном увеличении с последующим фотографированием. По гистологическим препаратам срезов глазных яблок оценивали морфологическое состояние внутриглазных структур с помощью световой микроскопии под разными увеличениями.