2.2. Методы насыщения антиглаукоматозных дренажей селективными иммунодепрессантами

     Поскольку циклоспорин А и эверолимус являются липофильными веществами, имеющими крайне низкую растворимость в воде (30 мкг/мл и 1,63 мкг/мл при 25 °С соответственно), очень сложно добиться их сорбции большинством полимерных материалов, используемых при изготовлении антиглаукоматозных дренажей. Анализ литературы позволил сделать вывод, что наиболее подходящим для данных целей материалом является полимолочная кислота. Главным преимуществом дренажей на основе данного полимера в контексте нашего исследования является гидрофобность, обеспечивающая способность дренажа сорбировать липофильные лекарственные вещества, а также препятствовать клеточной адгезии. Дренажи на основе полимолочной кислоты обладают наиболее оптимальным периодом биодеградации (4-8 месяцев), достаточным для оказания антипролиферативного эффекта, но при этом не слишком избыточным, при котором может наблюдаться инкапсуляция и кальцификация дренажа. Кроме того, доказано, что антиглаукоматозные дренажи на основе полимолочной кислоты обладают наибольшей биосовместимостью и ареактивностью [23, 24, 76, 85, 87].

    Учитывая вышеизложенные данные, биорезорбируемый антиглаукоматозный дренаж на основе полимолочной кислоты (ООО «Хайбитек», Россия) был выбран в качестве платформы для насыщения ЦсА и эверолимусом. Была исследована способность двух моделей дренажа, имеющих одинаковый химический состав, но разную физическую структуру, к сорбции иммунодепрессантов: пористой модели с размерами пор 30-50 мкм и микроволокнистой, изготовленной по технологии Biospin.

    Разработку способа насыщения антиглаукоматозных дренажей селективными иммунодепрессантами проводили на базе лаборатории физико-химических методов анализа строения вещества Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

    2.2.1. Методы определения способности дренажей к сорбции селективных иммунодепрессантов

    Для выявления способности вышеуказанных моделей к сорбции ЦсА образцы дренажей в виде полосок стандартных размеров 10,4 мм × 2 мм × 75 мкм выдерживали в разведениях концентрата для приготовления раствора для внутривенных инфузий с содержанием действующего вещества 50 мкг/мл (Сандиммун, Novartis Pharma, Швейцария, далее - концентрат) в убывающих концентрациях. Исследовали следующие разведения концентрата сбалансированным солевым раствором (BSS): 1:0 (50,0 мг/мл), 1:1 (25,0 мг/мл), 1:2 (16,6 мг/мл), 1:4 (10,0 мг/мл), 1:7 (6,3 мг/мл), 1:15 (3,1 мг/мл) и 1:30 (1,6 мг/мл).

    Образцы дренажей выдерживали в растворах с вышеуказанными концентрациями ЦсА в течение 5, 10, 15 и 30 минут. Для каждого разведения ЦсА и для каждого времени экспозиции исследовали по 5 образцов дренажей. По истечении времени экспозиции дренажи извлекали из растворов, промокали фильтровальной бумагой и высушивали в вакуум-сушильном шкафу при 30°С.

    Поскольку концентрат ЦсА, помимо действующего вещества, содержит вспомогательные, необходимые для его растворения в воде (полиоксиэтилированное касторовое масло в количестве 650 мг/мл и этанол 96% в количестве 278 мг/мл), с высокой точностью определить содержание ЦсА в образцах дренажей по приросту массы невозможно. Поэтому дренажи подвергали измельчению и определяли содержание ЦсА в образцах методом высокоэффективной жидкостной хроматомасс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС) на хроматографической системе Prelude SPLC (Thermo Fisher Scientific, США), сопряженной с тройным квадрупольным масс-спектром TSQ Endura (Thermo Fisher Scientific, США). Хроматографический анализ выполняли в градиентном режиме на колонке Accucore PFP (Thermo Fisher Scientific, США). Подвижную фазу А представляла собой вода с 0,1% раствором муравьиной кислоты, подвижную фазу В - ацетонитрил с 0,1% раствором муравьиной кислоты. Исследование проводили в режиме мониторинга множественных реакций. Калибровочные растворы были изготовлены из 10 мг навески порошка циклоспорина А (98,5%, Sigma-Aldrich, США). Образцы исследуемых дренажей помещали в 1,5 мл смеси ацетонитрила и воды в соотношении 1:1. Затем вышеуказанные растворы разбавляли в 100 раз и проводили хромато-масс-спектрометрию (Рисунок 4).

    Ввиду высокой гидрофобности и отсутствия растворимой лекарственной формы эверолимуса, для насыщения пористой и микроволокнистой моделей дренажа на основе полимолочной кислоты данным иммунодепрессантом предварительно получали 1%, 2% и 3% суспензию препарата. Для этого порошок эверолимуса (>95%, Sigma-Aldrich, США) тонко измельчали, необходимое его количество помещали в физиологический раствор и воздействовали ультразвуковыми волнами мощностью 630 Вт частотой 22 кГц в течение 0,5-1,0 минуты с помощью ультразвукового диспергатора И100-6/1 (ООО «Инлаб», Россия). Образцы дренажей взвешивали на микровесах (NETZSCH-Geratebau GmbH, Германия). В полученную суспензию помещали образцы дренажей и воздействовали ультразвуковыми волнами с вышеуказанными параметрами в течение 2-8 минут в случае насыщения пористой модели и 2-5 минут в случае микроволокнистой. Далее дренажи извлекали из суспензии, промокали фильтровальной бумагой и высушивали в вакуум-сушильном шкафу при 30 °С. Для выявления количества сорбированного эверолимуса образцы дренажей повторно взвешивали на микровесах. Количество сорбированного эверолимуса определяли по приросту массы дренажа.

    2.2.2. Методы исследования десорбции селективных иммунодепрессантов из материала дренажей

    Для определения динамики высвобождения циклоспорина А и эверолимуса из дренажей in vitro создавали экспериментальные условия, моделирующие зону операции после гипотензивного вмешательства. За скорость оттока ВГЖ принимали среднее значение согласно данным литературы - 3 мл/сутки. Образцы дренажей выдерживали в закрытых емкостях с BSS соответствующего объема (0,75 мл в случае определения концентрации за 6 часов и 3 мл в случае определения концентрации за сутки) в шейкере-инкубаторе ES-20/60 (Biosan, Латвия) при температуре 37 °С (50-60 оборотов/мин). Через каждые 6 часов в течение 1 суток и через каждые 24 часа в последующий период времени дренажи извлекали из растворов и перемещали в новые для продолжения эксперимента. Концентрацию ЦсА определяли с помощью ВЭЖХ-МС по методике, описанной в разделе 2.2.1 настоящей главы. При этом ввиду невозможности определения исходного количества ЦсА непосредственно в дренажах без их разрушения, для его определения использовали по 3 дополнительных дренажа, которые насыщали в заданных условиях и затем определяли количество сорбированного ЦсА с помощью ВЭЖХ-МС. За исходное значение принимали среднее арифметическое.

    Для определения концентрации эверолимуса дренажи взвешивали на микровесах до и после вымывания в растворе.

    Концентрацию (C) рассчитывали по формуле: C=Δm/V, где Δm – разность масс дренажа до и после экспозиции в растворе, V – объем раствора, равный оттоку ВГЖ за заданный промежуток времени.