2.2.Второй этап. Подготовка ретинального пигментного эпителия к трансплантации методом трехмерного клеточного культивирования

     Сегодня имеются различные технические способы культивирования клеток для получения сфероидов – культивирование на вязких питательных средах [165, 235], на гидрофобных поверхностях [80], внутри пористых материалов [128], при механической ротации культурального сосуда [289], при культивировании клеточной суспензии в микролунках с неадгезивным покрытием [250]. Несмотря на наличие в литературе единичных упоминаний о формировании сфероидов РПЭ с целью изучения его биологии [235], не удалось найти данных о трехмерном культивировании донорского РПЭ с целью его подготовки к трансплантации, а именно – нет никаких рекомендаций относительно оптимальных посевных количеств клеток РПЭ в одном сфероиде и оптимальных сроков 3D культивирования, что позволило сформулировать вторую задачу исследования.

    2.2.1. Первичное 2D культивирование ретинального пигментного эпителия

    При 3D культивировании зрелых соматических клеток традиционно используют клеточный материал, предварительно культивированный на плоскости (в 2D). Культивирование 2D выполняет две функции: позволяет получить достаточное для дальнейших экспериментов количество клеток, а также способствует стабилизации или деградации культуры, в зависимости от количества и энергетического потенциала клеток в первичной культуре, т.е. играет роль естественного теста жизнеспособности донорского материала. Для второго этапа использовали суспензии клеток РПЭ, полученные в опытной группе на первом этапе работы (11 суспензий – по одной из каждого донорского глазного яблока, рассмотрено раздел 2.1.1).

    Суспензию клеток центрифугировали в режиме 1800 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок разбавляли 2 мл питательной среды на основе полной ростовой среды Игла в модификации Дульбекко и среды Хэма F12 в соотношении 1:1 по объему с L-глутамином (DMEM/F12; 89% об.) с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (Fetal bovine serum, FBS; 10 % об.), смеси антибиотиков (1,0 % об.). Количество клеток 40 подсчитывали в камере Горяева, отмеряли количество суспензии, содержащее 0,3х10⁶ клеток РПЭ (таб. 4) и переносили в чашку Петри (35 мм), поверхность которой была предварительно смочена FBS. Чашку Петри накрывали крышкой и инкубировали в стандартных условиях. Первую смену питательной среды проводили спустя 10 дней культивирования, далее - каждые 3-4 дня. Таким образом получали первичную клеточную культуру т.н. нулевого пассажа, P0.

    Иммуногистохимическое исследование первичной культуры РПЭ

    Для молекулярной идентификации первичных клеточных культур часть клеточной суспензии при пассировании переносили на адгезивные стекла и культивировали внутри чашек Петри (35 мм) в стандартных условиях в течение 2 суток, после чего проводили иммуногистохимическое окрашивание на ряд специфических белковых маркеров – RPE65, ZO-1, E-cadherin и виментин.

    RPE65 – специфический фермент клеток РПЭ массой 65 кДа, один из ключевых белков зрительного цикла. Располагается преимущественно в мембране гладкого эндоплазматического ретикулума (Kiser PD, Palczewski K, 2010).

    Плотные межклеточные контакты – близко расположенные области двух клеток, чьи мембраны соединяются вместе, формируя практически непроницаемый барьер для жидкостей [210]. Плотные контакты наиболее выражены в эпителиальных тканях, в том числе в пигментном слое сетчатой оболочки. ZO-1 и E-кадгерин являются компонентами плотных межклеточных контактов, широко использующихся при иммуногистохимическом маркировании клеток РПЭ.

    ZO (лат. zonula occludens) – семейство белков, входящих в состав плотных межклеточных контактов, располагающихся с внутренней стороны плазматической мембраны и соединяющих область плотного контакта с элементами цитоскелета клетки. ZO-1 – белок семейства ZO, типичный для клеток РПЭ [210].

    Кадгерины (англ. Cadherins, «Ca ²⁺ -dependent adhesion») – семейство гликопротеинов, которые опосредуют кальций-зависимую межклеточную адгезию в точках соединения клеток и участвуют в сложных сигнальных путях, затрагивающих клеточный фенотип. Превалирующий тип кадгерина может отличаться в зависимости от типа ткани. E-кадгерин является основным кадгерином большинства монослоев эпителиальных клеток и в клетках РПЭ располагается рассеянными группами на стыках клеток и маркером эпителиального состояния клеток [51].

    Виментин – белок промежуточных филаментов III типа, основной компонент цитоскелета мезенхимальных клеток; увеличение количества виментина служит маркером эпителиально-мезенхимального перехода.

    Окрашенные клеточные культуры изучали на конфокальном микроскопе. Результаты иммуногистохимических исследований 2D культур представлены в разд. 3.2.1.

    2.2.2. Клеточное 2D субкультивирование ретинального пигментного эпителия

    Клетки РПЭ, будучи дезагрегированными из естественной тканевой ниши и первично культивируемые, проходят стандартные начальные фазы культурального роста – lag-фазу (фазу адаптации, в течение 2-3 недель) и log-фазу (фазу экспоненциального роста). Как только эпителиальные клетки начинают контактировать друг с другом (слияние, конфлюэнция), экспрессируя белки межклеточной адгезии, клеточное деление замедляется, и культура выходит на фазу плато [21].

    Суммарное количество клеток РПЭ в глазу взрослого человека составляет от 2 до 4х10⁶ клеток [209]. Количество клеток РПЭ, которые можно выделить из трупного глаза с приемлемым уровнем их жизнеспособности, составляет менее 1*10⁶ [295]. Целью субкультивирования является поддержание пролиферативного потенциала клеточной культуры и наращивание достаточного для экспериментальной работы количества клеток. Минимальное количество клеток в каждой 2D культуре перед проведением трехмерного культивирования должно было составлять 2,5х10⁶ клеток (см. разд. 2.2.3. и разд. 3.2.2.), в то время как количество клеток в конфлюэнтной культуре на дне большой чашки Петри (10 см) в конце этапа субкультивирования может достигать 8,8*10⁶ (таб. 4).

    На 3-й--4-й неделях первичного культивирования по достижении клеточным слоем в первичной культуре 80-90% конфлюэнтности проводили первое пассирование культуры – питательную среду заменяли смесью 0,25% раствора трипсина-ЭДТА и раствора Версена (1:1 по объему) и инкубировали в стандартных условиях в течение 5-10 минут; суспензию отделившихся от субстрата клеток переносили в центрифужную пробирку, в которую для нейтрализации ферментативной смеси добавляли 1 мл FBS, и центрифугировали в режиме 1800 об/мин в течение 5 мин, надосадочную жидкость удаляли. Осадок разбавляли 2 мл питательной среды и переносили на чистую чашку Петри (35 мм). Образец суспензии объемом 20 мкл использовали для подсчета клеток в камере Горяева. Смену питательной среды проводили каждые 2-3 дня; последующие циклы пассирования-культивирования – каждые 7 дней до получения устойчивого конфлюэнтного монослоя в чашках Петри большего диаметра (100 мм), что позволяло за 5-6 пассажей (культуры P5-P6) увеличивать количество клеток до 5*10⁶ и более клеток.

    Иммуногистохимическое исследование пассированных клеточных культур РПЭ

    Для отслеживания изменений клеточного фенотипа при клеточном субкультивировании клетки пассажей P5-P6 исследовали на те же иммуногистохимические маркеры, что и при изучении первичной культуры, -RPE-65, ZO-1, E-кадгерин и виментин – по той же методике (разд. 2.2.1). Окрашенные клеточные культуры изучали на конфокальном микроскопе. Результаты иммуногистохимических исследований 2D культур представлены в разд. 3.2.1.

    2.2.3. Трехмерное клеточное культивирование

    Разработка оригинальной техники подготовки клеток РПЭ к трансплантации методом 3D клеточного культивирования описана в разделе 3.2.2.

    По разработанной методике было получено 880 висячих капель (3D культур РПЭ) объемом 20 мкл каждая. За динамикой формирования сфероидов внутри висячих капель следили ежедневно с помощью инвертированного микроскопа в течение 28 дней, давая качественную оценку наблюдаемым явлениям, а также фотографируя содержимое капель на 1, 2, 4, 7, 14, 21 и 28 сутки, производя затем измерения диаметра формирующихся микроагрегатов (о технике измерений см. в разделе 2.7), что давало основание судить о степени их созревания.

    Иммуногистохимическое исследование сфероидов РПЭ

    Для иммуногистохимического исследования отдельно формировали сфероиды в количестве 100-200 штук различной морфологии (см. разд. 3.2.3), фиксировали раствором 4% параформальдегида, наносили на поверхность адгезивного стекла, и окрашивали тем же набором иммуногистохимических маркеров, что и при исследовании 2D культур (см. разд. 2.2.1, 2.2.2), после чего окрашенные препараты исследовали на конфокальном микроскопе.