2.3. Исследование биосовместимости материала опорной пластины кератопротеза на модели двумерного культивирования в эксперименте in vitro

     Изучение пролиферативной активности и адгезивных свойств клеток проводили на экспериментальной модели двумерного культивирования выделенных клеток стромы роговицы (КСР) в присутствии исследуемых ОПК модели №1 и №2.

    Протокол выделения КСР:

    1. Выкраивание центральной зоны роговицы трепаном 8 мм.

    2. Механическая дезагрегация роговицы хирургическими ножницами.

    3. Химическая дезагрегация роговицы в растворе коллагеназы 2-го типа (MPBiomedicals, LLC, США), (20 мин, 37° С).

    4. Центрифугирование в режиме 1800 об/мин при температуре 37 ° С (Центрифуга SL-40 R, Thermo Scientific, Германия).

    5. Перенос полученной взвеси клеток в чашку Петри диаметром 35 мм с добавлением питательной среды:DMEM/F12 (ПанЭко, Россия), эмбриональная телячья сыворотка 5% (HyClone, США), смесь антибиотиков 1% (Sigma Aldrich, Канада), L-глутамин 2 ммоль/л (ПанЭко, Россия).

    В результате получали первичную 2D культуру КСР (рисунок 3).

    Экспериментальные исследования были направлены на изучение в условиях in vitro реакции взаимодействия выделенных КСР с исследуемыми ОПК, имеющими различную структуру ячеек. Исследовали 8 образцов двух моделей ОПК. В условиях ламинара (Ламинарый бокс II класса безопасности MSC-Advantage, Technologies, Германия) стерильные образцы пинцетом помещали в чашки Петри (d=35мм) с добавлением культуры КСР объемом 3*10⁵ /мл. В контрольной группе суспензию клеток в таком же количестве вносили в пустую чашку Петри (d=35мм).

    Данная группа была сформирована с целью контроля роста клеточной культуры. Проводили культивирование в стандартных условиях (температура 37° C, концентрация CO₂ – 5%, влажность – 95%) в инкубаторе NU-5510 (Nu-Aire, США). Питательную среду заменяли раз в три дня.

    Оценку плотности монослоя культуры клеток осуществляли при помощи инвертированного микроскопа IX-81 (Olympus, Япония) в течение 9 суток.

    Выполняли фоторегистрацию с помощью цифровой фотокамеры (микроскоп IX-81 c цифровой камерой ХС-10, Olympus, Япония). Для оценки адгезии клеток к поверхности ОПК осуществляли окраску ядер флуоресцентным красителем бисбензимидом – Hoehst 33258, с последующей оценкой на конфокальном лазерно-сканирующем микроскопе (Fluoview FV10I, Olympus, Япония).