2.3. Криоконсервация децеллюляризированного лентикулярного материала

     Спектрофотометрия для дегидратированного децеллюляризированного лентикулярного материала перед его криоконсервацией

    На данном этапе исследований изучали влияние предварительной дегидратации ЛМ на сохранение прозрачности перед криозамораживанием (Рисунок 8). В качестве криопротектора использовался ДМСО (PanReac AppliChem, Германия) [71, 125]. Дегидратация осуществлялась с помощью ДВ. Для децеллюляризации, использовали протокол с 1,5М NaCl с ДНКазой 5 Ед/мл и РНКазой 5 Ед/мл как наиболее эффективный в отношении удаления клеточных компонентов и сохранении прозрачности ЛМ [163, 196]. Прозрачные свойства исследовали с помощью метода спектрофотометрии, описанным в главе 2.2.

    Было сформировано три группы. Две группы были опытные (децеллюляризированные образцы без дегидратации и с предварительной их дегидратацией перед криоконсервацией), а одна являлась контрольной (нативные ЛМ) (Таблица 6). В группе с предварительной дегидратацией образцы помещали в ДВ от 30 минут до 1 часа. Данные спектрофотометра собирались и анализировались в соответствии с представленной формулой в главе 2.2.

    2.3.1. Протокол криоконсервации децеллюляризированного лентикулярного материала с использованием ДМСО

    Данный протокол выполнялся в стерильных условиях ламинарного бокса II класса безопасности. Образцы опытных групп сначала отмывали трехкратно в PBS по 5 минут с последующим их переносом в криопробирки (Corning,США), содержащие 1 мл 90% «Раствора для хранения роговицы» (ООО НЭП «Микрохирургия глаза», Москва) и 10% ДМСО (PanReac AppliChem, Германия). Далее криопробирки помещали в контейнер для криоконсервации Cool Cell LX (Biocision, США) и в низкотемпературный холодильник (-80 °С) на ночь. Снижение температуры осуществлялось постепенно со скоростью 1°С в минуту. На следующий день контейнер переносили в Сосуд Дьюара (Cryo Diffusion, Франция) с жидким азотом с температурой –196°С. Затем через 2 дня образцы сначала размораживали на водяной бане при +37 °С в течение 5 мин. В день эксперимента проводили трехкратный цикл отмывания образцов: сначала трехкратно по 5 минут отмывали в растворе PBS; далее отмывали в PBS при постоянном встряхивании в термошейкере при комнатной температуре в течение 12-15 часов; на следующий день трижды отмывали в PBS по 5 минут.

    Спектрофотометрия и сканирующая электронная микроскопия для разных протоколов криоконсервации децеллюляризированного лентикулярного материала

     Для оценки прозрачности и толщины фибрилл коллагеновых волокон криоконсервированных ДЛМ использовали спектрофотометрический метод и метод сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). В качестве детергентов применяли протокол с 1,5М NaCl + ДНКаза 5 Ед/мл РНКаза 5 Ед/мл (NaCl) и 0,1% раствор SDS (SDS) [163, 196]. Данные протоколы децеллюляризации были описаны в главе 2.2. Для криоконсервации образцов использовали следующие среды: Криодерм на основе глицерина (ПанЭко, Россия) (Криодерм), раствор ДМСО (PanReac AppliChem, Германия), 100% раствор глицерина (PanReac AppliChem, Германия). Перед криоконсервацией не проводили предварительную дегидратацию децеллюляризированных ЛМ. Для выбора лучшего протокола криоконсервации были сформированы 6 опытных групп согласно используемому детергентному веществу и криопротектору, и 1 контрольная с нативными образцами (Таблица 7).

    Для устранения отека образцов, возникающего после криконсервации ДЛМ, использовался ДВ. Для оценки светопропускания ЛМ предварительно дегидратировали в ДВ от 30 минут до 1 часа. Спектрофотометрическое исследование проводилось согласно протоколу, представленному в главе 2.2.

    Состояние фибриллы коллагенового волокна проводилась в соответствии с протоколом, описанным в главе 2.2. Анализ данных проводился в пяти случайно выбранных точках центральной зоны (3 мм) образца.

    2.3.2. Описание протоколов криоконсервации децеллюляризированного лентикулярного материала

    На данном этапе проводился подбор оптимальных криопротекторов, позволяющих сохранить высокие показатели прозрачности и структурную организацию коллагенового каркаса ЛМ.

    Протокол криоконсервации децеллюляризированного лентикулярного материала (NaCl и SDS) с использованием ДМСО

     Описание протокола хранения образцов в ДМСО для протоколов децеллюляризации NaCl и SDS был аналогичен, протоколу, где изучали влияние предварительной дегидратации ЛМ на сохранение прозрачности перед криозамораживанием, описанным в главе 2.3.1.

    Протокол криоконсервации децеллюляризированного лентикулярного материала (NaCl и SDS) с использованием среды Криодерм

    Криодерм на основе глицерина (ПанЭко, Россия) является отечественной разработкой. Как заявляет компания–производитель данной среды, ее можно использовать для криоконсервации клеток и тканей в хирургии и офтальмологии при создании запасов трансплантатов роговицы и кожи [210]. Хотя производитель рекомендует хранить клетки при температуре -18 °С. В данном исследовании мы использовали более глубокую температуру заморозки для длительного хранения образцов. Последовательность выполнения процедуры хранения образцов в среде Криодерм не отличалась от протокола криоконсервации в ДМСО. Протокол хранения образцов в ДМСО был описан в главе 2.3.1.

    Протокол криоконсервации децеллюляризированного лентикулярного материала (NaCl и SDS) с использованием глицерина

    После трехкратного отмывания ДЛМ в PBS образцы переносили в криопробирки (Corning, США), содержащие 1 мл 100% раствора глицерина (PanReac AppliChem, Германия). Затем криопробирки помещали в контейнер для криоконсервации Cool Cell LX (Biocision, США) и помещали в низкотемпературный холодильник) при температуре -80 °С на трое суток. Далее образцы изымали из холодильника и размораживали на водяной бане (+37 °С) в течение 5 минут. В конце их трижды отмывали в растворе PBS по 5 минут (Рисунок 9).

     Подтверждение стерильности криоконсервированного лентикулярного материала после децеллюляризации

    Поскольку все предшествующие этапы работы с ЛМ проводились в условиях стерильности, поэтому для ее подтверждения проводили анализ стерильности образцов с помощью санитарно-бактериологического исследования. Для данного исследования были выбраны пять случайно выбранных образцов, которые хранились в сосуде Дьюара при температуре –196˚C (срок хранения 14-21 суток). Контроль предоставленного материала проводился на базе головной организации ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России в соответствии с изменениями №3 к статье Государственной фармакопеи XI издания «Методы микробиологического контроля лекарственных средств» (ГФ ХI, вып.2, с.187) под руководством Табунова В.С. Посев проводился на жидкую тиогликолевую среду (инкубация при температуре 20-22˚C) и жидкую среду Сабуро (инкубация при температуре 36,5˚C) для определения микробной обсемененности, а также для выявления плесневых и дрожжевых грибов. Учет контроля стерильности проводился в течение 14 суток.