2.3. Методы определения эффективности и безопасности пролонгированного применения селективных иммунодепрессантов in vitro

    В доступной на сегодняшний день литературе не опубликовано исследований по определению концентраций циклоспорина А и эверолимуса, оказывающих прямой антипролиферативный эффект на фибробласты теноновой капсулы человека – основных клеток, подвергающихся действию препаратов при выполнении гипотензивных вмешательств, что обусловило необходимость проведения данного этапа исследования.

    Серию экспериментальных исследований in vitro на культурах клеток проводили в соответствии со стандартом ISO 5 на базе лаборатории культур клеток биотехнологического центра «БиоТех» ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России в лаборатории культур клеток биотехнологического отдела, оснащенной комплексом «чистых помещений» класса Б с возможностью создания зон класса А.

    2.3.1. Методика получения первичных культур клеток

    В ходе выполнения данного этапа исследования была разработана технология получения первичных культур фибробластов из донорских образцов теноновой капсулы человека.

    Для получения первичных культур образцы теноновой капсулы человека (7 образцов, размер 2 × 2 мм) были изъяты у пациентов ГБУЗ СОКОБ им. Т.И. Ерошевского путем прижизненной биопсии во время выполнения хирургического лечения заболеваний глаз после получения добровольного информированного согласия и одобрения Комитетом по биоэтике при СамГМУ и локальным этическим комитетом ГБУЗ СОКОБ им. Т.И. Ерошевского. Доноры ранее не подвергались хирургическому лечению офтальмологической патологии, не страдали хроническими инфекционными, онкологическими заболеваниями, сахарным диабетом, не получали гормональную терапию, цитостатики и другие лекарственные вещества, влияющие на пролиферативную активность клеток. Транспортировку донорского материала осуществляли в стерильном пенициллиновом флаконе, наполненном физиологическим раствором.

    Материал был извлечен из транспортировочного флакона стерильным пинцетом и перенесен в лабораторную чашку Петри со стерильным раствором Хенкса. Транспортировочный флакон со средой помещали в термостат на 24 часа для проведения теста на стерильность. Через 24 часа признаков контаминации и микробного обсеменения не было выявлено ни в одном случае.

    После трехкратной отмывки фрагментов теноновой капсулы от крови и слизи приступали к механическому измельчению материала. Отработанный раствор отбирали стерильными пипетками и проводили ферментативную обработку донорского материала раствором коллагеназы из поджелудочной железы краба 0,1% в течение 1 минуты. Инактивировали действие фермента стерильным раствором Версен 0,02% (реактивы ООО «Биолот», Россия).

    Клетки были получены по методике первичных эксплантатов, описанной К.Н. Гринбергом [25, 32], с использованием полной ростовой среды (среда 199 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ООО «Биолот») и 40 мкг/мл гентамицина в СО₂ –инкубаторе МСО-18АC (Sanyo – Incubator, MCO-18 A, Япония) при 5% СО₂, температуре 37 °С и постоянной влажности. Обследование методом полимеразной цепной реакции показало отсутствие контаминации культуры инфекционными агентами, в том числе микоплазмами и цитомегаловирусом.

    2.3.2. Определение антипролиферативной активности и цитотоксичности циклоспорина А и эверолимуса

    Фибробласты теноновой капсулы человека высевали на дно лунок 96-луночных культуральных планшетов в дозе 2 × 10⁴ клеток/см² и культивировали в стандартных условиях с использованием полной ростовой среды. При достижении 80% конфлуентности монослоя из лунок отбирали культуральную среду и заменяли ее свежей, в состав которой вводили препарат.

    Для получения исследуемых питательных сред группы ЦсА в образцы добавляли концентрат данного препарата (Сандиммун, Novartis Pharma, Швейцария) до получения требуемых концентраций препарата: 0,05 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл и 2 мкг/мл.

    Для получения питательной среды с требуемой концентрацией эверолимуса, использовали его порошок (>95%, Sigma Aldrich, США), который предварительно разводили в 0,02 мл диметилсульфоксида (ДМСО) (ООО «Биолот», Россия) до получения следующих концентраций препарата в питательной среде: 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 5 мкг/мл, 10 мкг/мл, 15 мкг/мл и 20 мкг/мл.

    Планшеты помещали в СО₂ - инкубатор при постоянной влажности и температуре. Культивирование производили в течение 7 дней.

    Группой контроля служила культура фибробластов теноновой капсулы человека в полной ростовой питательной среде без добавления лекарственных препаратов в эксперименте с ЦсА и без добавления препаратов, но с внесением 0,02 мл ДМСО в серии исследований с эверолимусом.

    В каждой серии эксперимента использовали по 5 повторов культур клеток для каждой группы.

    Ежедневно производили визуальную оценку и фоторегистрацию культуры с помощью аппаратно-программного комплекса (АПК) на основе инвертированного микроскопа Olympus CKX 41 («Olympus», Япония) при увеличении × 100 и × 200 с использованием программного обеспечения CellSens Standart 1.7 («Olympus», Япония). Оценивали структурные особенности клеток и монослоя в целом, считали количество клеток на 1 мм².

    По окончании эксперимента монослой окрашивали витальным красителем трипановым синим по стандартной методике с целью выявления клеток с поврежденными мембранами. Раствор трипанового синего не проникает через неповрежденные клеточные мембраны, поэтому окрашивание ядра в синий цвет свидетельствует о нарушении жизнеспособности клетки. Равномерно интенсивно окрашенные клетки считают нежизнеспособными. Для выявления внутриклеточных липидных включений и общей оценки структуры монослоя применяли гистологическую окраску суданом IV и гематоксилином Майера. С помощью окраски набором флуорофоров («Live/Dead Cell-Mediated Cytotoxicity Kit», Invitrogen, США) определяли жизнеспособные клетки, характеризовавшиеся зеленой флуоресценцией и поврежденные клетки с красной флуоресценцией ядер. Принцип действия флуоресцентных красителей аналогичен описанному выше: через неповрежденные мембраны живых клеток может проникнуть лишь компонент набора, характеризующийся зеленым свечением (DiOC₁₈), в то время как второй компонент (пропидия йодид) проникает в клетку лишь при условии повреждения мембраны. В клетке пропидия йодид проникает в ядро, где связывается с ДНК, что и обусловливает красное свечение ядер поврежденных клеток. Анализ окрашенных препаратов, фоторегистрацию и морфометрию производили с помощью АПК на основе исследовательского микроскопа Olympus ВX41 («Olympus», Япония), с использованием программного обеспечения «Морфология 5.2» («ВидеоТесТ», Россия) и CellSens Standart 1.7 («Olympus», Япония) при увеличении × 100, × 200 и × 400.

    Пролиферативную активность и жизнеспособность клеток характеризовали на основании следующих показателей: плотность монослоя, индекс пролиферации, время удвоения культуры, количество удвоений, доля поврежденных клеток в монослое, ядерно-цитоплазменное соотношение.

    Плотность монослоя (количество клеток на 1 мм²) считали в нативных препаратах с использованием программного обеспечения CellSens Standart 1.7 («Olympus», Япония).

    Формулы, по которым производили расчет показателей, представлены ниже: Индекс пролиферации (PI): PI = N_t/N₁, Время удвоения культуры (DT): DT = t x lg2/lg(N_t /N₁), Количество удвоений культуры (PDL): PDL = (lg(N_t) - lg(N₁))/lg2, где N₁ – плотность клеток в монослое через 24 часа после посадки клеток, N_t – количество клеток монослоя на момент определения показателя, t – время роста культуры (часы).

    Ядерно-цитоплазменное отношение (ЯЦС): ЯЦС = S_N/S_c, где S_N – площадь ядра, S_c – площадь цитоплазмы.

    В окрашенных гематоксилином и суданом IV препаратах с использованием программного обеспечения CellSens Standart 1.7 определяли площадь клетки и её ядра (S_N). Для получения площади цитоплазмы (S_c) из 1-го показателя вычитали 2-й.