2.3.Третий этап. Разработка критериев трансплантабельности сфероидов ретинального пигментного эпителия

    Для формирования сфероидов на третьем этапе работы были использованы культуры клеток, полученные на первом этапе (см. разд. 3.1.1) и криоконсервированные на втором (см. разд. 3.2.1).

    Используемые культуры клеток РПЭ были разделены на две группы, согласно результатам адреналиновой пробы донорских глаз, из которых были получены клеточные 2D культуры – на группу А и группу В (6 культур в группе А, 5 культур в группе В). Из каждой клеточной культуры (11 культур) по протоколу, описанному в разделе 3.2.1., формировали сфероиды в избыточном количестве (учитывая различную вероятность образования «гладких» и «бахромчатых» сфероидов), из которых затем отбирали по 16 сфероидов различных посевных количеств клеток (500, 1000, 5000, 25000, 125000 клеток на висячую каплю) и обоих типов морфологии. Всего было отобрано 1760 сфероидов РПЭ (160 сфероидов от каждого из 11 доноров). Культуры клеток, оставшиеся после получения сфероидов, подвергались криоконсервированию до востребования на четвертом этапе (разд. 2.6.2).

    По 12 сфероидов из Группы А и по 10 из Группы В (по 2 сфероида одного посевного количества от каждого донора) извлекали из 3D культуры в различные сроки (7, 14, 21 и 28 дней), переносили в пробирки (1,5 мл) с фосфатно-солевым буфером (pH 7,4) для отмывания остатков питательной среды (сфероиды одной группы смешивали в одной пробирке), затем в пробирку со смесью 0,25% трипсина-ЭДТА и Версена (1:1 по об.), инкубировали в стандартных условиях в течение 5 минут, дезагрегировали клетки пипетированием и проводили тест на жизнеспособность с трипановым синим, как описано в разд. 2.6.3.

    По 12 других сфероидов из Группы А и по 10 из Группы B различных посевных количеств клеток и раличной морфологии извлекали из 3D культуры в различные сроки (7,14,21 и 28 дней) и переносили на дно лунок 24 -луночных планшетов по одному сфероиду в лунку. Начальные этапы адгезии сфероидов определяли микроскопически по прекращению их свободной флуктуации в растворе при действии низкочастотных механических колебаний (проводили тест с легкой перкуссией столешницы, на которой установлен инвертированный микроскоп), а также по появлению первых признаков распластывания (спрединга) клеточного слоя вокруг сфероида.