2.4 Исследование донорских роговиц, консервированных в среде собственной рецептуры

    Морфологическая оценка заднего эпителия роговицы и изучения архитектоники сформированных ультратонких трансплантатов

     Морфологическая оценка и подсчет количества клеток эндотелия донорских роговиц, а также изучения архитектоники сформированных ультратонких трансплантатов проводили на растровом сканирующем электроном микроскопе «Jeol JSM-6000 PLUS» (Jeol, Япония). Для всех образцов была использована стандартная методика подготовки проб и стандартный протокол настроек сканирующего электронного микроскопа. Все этапы включали в себя следующие действия:

    1. Для удаления остаточного загрязнение после фиксации в нейтральном 10% формалине, образцы промывали 3-х кратно раствором PBS.

    2. Для дегидратации образцов использовали раствор ацетона в восходящей концентрации (10, 20, 30, 50,70,90,100х3) по 30 минут.

    3. Для удаления раствора ацетона, образцы помещали в сушку в критической точке в парах CO₂ при возрастающем давлении до 1250 psi +37⁰С в течение 120 мин на приборе «Quorum EMS 850» (Quorum, Великобритания).

    4. Для обеспечения электронно-проходящего слоя дегидратированные образцы помещали на предметные столики для электронной микроскопии с последующим напылением золота (толщина слоя 5 нм) с использованием «Smart Coater» (Jeol, Япония).

    5. Далее образцы помещались в камеру сканирующего электронного микроскопа, анализ осуществлялся в условиях высокого вакуума при ускоряющем напряжении 15 кВ.

    Трансмиссионная электронная микроскопия

    Для изучения на трансмиссионном электронном микроскопе сохранности митохондриального аппарата эндотелиальных клеток роговицы, а также ультраструктурных особенностей было получено 12 пар корнеосклеральных дисков из Глазного тканевого банка ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России.

    Полученные корнеосклеральные диски делили на две группы:

    Контрольная группа (n=12) – консервацию проводили в растворе для хранения роговицы (Борзенка-Мороз).

    Опытная группа (n=12) – консервацию проводили в среде собственной рецептуры.

    Все роговицы подвергались гипотермической консервации при +4…6⁰С в течение 1х (n=6), 3х (n=6), 7ти (n=6) и 9ти (n=6) суток.

    ТЭМ выполнялся на базе лаборатории анатомии микроорганизмов «НИЦ Эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи».

    Полученные образцы фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида на 0,1М фосфатном буфере, в холодильнике при +4⁰С в течение 12 часов. Далее образцы отмывали 3-х кратно раствором PBS в течение 2-х часов. Контрастирование материала осуществляли 1% растворе четырехокиси осмия в течение 1,5 часов при комнатной температуре +25⁰С. Далее образцы дегидратировали в восходящей концентрации этанола: 25%; 30%; 50% (3-х кратно, по 5 мин); далее раствор заменяли на 70% р-р этанол + ацетат (1:1) в течение 2-х часов; 96% и 100% этанол (2 раза по 15 мин); 100% ацетон (2 раза по 20 мин). Стабилизацию образцов производили рабочей смесью ацетона и смесью смол в соотношении 1:1 в течение 2-х часов. Заливку образцов производили по общепринятой методике в ЭПОН-812. Полимеризация образцов проводили в течение 24-х часов при +37 0С, далее в течение 48-ми часов при +45 ⁰С и в течение 60-ти часов при +56 ⁰С. Полутонкие срезы толщиной 1 мкм готовили на ультратоме LKB-3 (Швеция), окрашивали толуидиновым синим, ориентацию материала проводил под световым микроскопом для дальнейшей заточки блока. Полученные срезы образцов контрастировали ацетатом уранила и цитратом свинца, исследовали в электронном микроскопе JEM 1200 EX II (Япония).

    Флуоресцентная микроскопия

    Для определения жизнеспособности эндотелиальных клеток роговицы в обеих группах после гипотермической консервации при +4…6⁰С проводили окрашивание Аннексином-V с контрастированием ядер Hoechst 33258 (Табл. 8). Для этого образцы 3-х кратно отмывали раствором PBS и добавляли смесь флуоресцентных красителей и окрашивали в течение 15 мин., далее образцы 3-х кратно отмывались раствором PBS. Анализ препаратов проводили на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе «Olympus Fluoview FV 10i» (Olympus, Япония).