Рисунок 2 – Моделирование щелочного ожога роговицы: А – аппликация хлопчатобумажного диска; Б – первичное повреждение роговицы щелочью. Увеличение х10
Рисунок 3 – Вид образца роговицы перед испытанием: А – свежевыкроенный корнеальный диск роговицы с захватом склеры; Б – роговица перед фиксацией между двух металлических пластин: В – вид фиксированной и готовой к испытанию роговицы
Результаты экспериментов оценивали морфологически, для этого по 2 кролика из каждой группы выводили из эксперимента через 1, 3 и 6 месяцев (всего 12 кроликов).
Параллельно, для исследования биомеханических характеристик роговицы, оставшихся животных (32 кролика) также выводили из эксперимента по 4 особи из каждой группы на сроках 1, 3, 6 и 9 месяцев.
Техника введения коллагенового имплантата в нативную роговицу кролика
Операцию на глазах кроликов выполняли под микроскопом M620 фирмы «Leica» (Германия) при увеличении в 15 раз; использовали расслаиватель и шовный материал фирмы «Mani» (Япония). Ход операции был следующим:
- для анестезии животным выполняли ретробульбарную блокаду 0,5% новокаином;
- производили разрез роговицы протяженностью 5 мм на 2/3 ее глубины концентрично лимбу, в данной плоскости при помощи расслаивателя формировали роговичный интрастромальный карман «от лимба до лимба», чтобы максимально приблизить данную методику к реальным условиям кератопротезирования;
- при помощи пинцета для завязывания и шпателя проводили имплантацию тканеинженерной конструкции в полость сформированного кармана, возникающие в некоторых случаях складки имплантируемого материала расправляли при помощи легкой компрессии, создаваемой шпателем на поверхности роговицы;
- на разрез накладывали шов по Пирсу;
- по окончании операции для профилактики инфекции производили подконъюктивальную инъекцию гентамицина сульфата 1,0% в объеме 0,5 мл.
Далее в течение одной недели инстиллировали окомистин (Miramistin) по 1 капле 2 раза в день. Для исключения риска самопроизвольного травмирования оперированного глаза и занесения инфекции, кроликам одевали специальные воротники.
In vivo эксперимент на ожоговых бельмах роговицы кроликов
Кролики были разделены на 2 группы, по тем же критериям. Всего в эксперименте участвовало 28 кроликов. Группу А составили 14 кроликов, в бельмо которых был имплантирован «чистый» коллагеновый носитель без фактора роста. В группу Б вошли 14 кроликов, в бельмо которых был имплантирован коллагеновый носитель, обогащенный фактором роста rhBMP-2. Морфологическую оценку, как и исследование биомеханических свойств проводили идентично предыдущему эксперименту. По 2 кролика из каждой группы выводили из эксперимента через 1, 3 и 6 месяцев (всего 12 кроликов). Оставшихся животных (32 кролика) также выводили из эксперимента по 2 особи из каждой группы на сроках 1, 3, 6 и 9 месяцев для исследования биомеханических свойств бельма.
Методика создания ожогового бельма роговицы кролика
Нанесение ожога выполняли под местной анестезией, за основу была принята методика, предложенная Е.В. Ченцовой, и модифицирована следующим образом: предварительно подготовленные бумажные диски диаметром 8 мм пропитаны 0,2 мл 3%-го раствора NaOH каждый, далее произведены аппликации хлопчато-бумажных дисков на поверхность роговицы животных в течение 30 секунд (Рисунок 2), глазное яблоко и конъюнктивальную полость обильно промывали 10,0 мл 0,9% NaCI, затем в течение 14 суток животные получали антибактериальную терапию – Офлоксацин (Ofloxacin) 0,3% в виде мази закладывали в конъюнктивальную полость 2 раза в день, и внутримышечное введение раствора гентамицина сульфата 1,0% 1,0 мл 1 раз в день.
Техника введения коллагенового имплантата в ожоговое бельмо роговицы кролика
В силу того, что бельмо роговицы кролика неравномерной толщины, визуальный контроль во время расслаивания затруднён, таким образом, риск перфорации значительно выше в сравнении с обычной роговицей, а подготовка бельма процесс длительный (6 месяцев) и расходовать экспериментальный материал крайне нежелательно, технику операции незначительно оптимизировали.
Операцию на глазах кроликов выполняли под микроскопом M620 фирмы «Leica» (Германия) при увеличении в 15 раз; использовали расслаиватель и шовный материал фирмы «Mani» (Япония). Ход операции был следующим:
- для анестезии животным выполняли ретробульбарную блокаду 0,5% новокаином;
- производили несквозную трепанацию бельма трепаном диаметром 8 мм, затем при помощи расслаивателя отсепаровывали переднюю поверхность бельма по трепанационному отверстию таким образом, что часть тканей оставалась на «ножке» в виде своеобразной «крышечки», это позволяло полностью минимизировать риск перфорации;
- оставшуюся периферическую часть расслаивали при помощи тупого шпателя, формируя при этом карман «от лимба до лимба» в строме;
- коллагеновый имплантат вводили в полость сформированного кармана и накрывали ранее отсепарованной тканью бельма на «ножке»;
- накладывали обвивной роговичный шов;
- по окончании операции для профилактики инфекции проводили подконъюктивальную инъекцию гентамицина сульфата 1,0 % в объеме 0,5 мл.
Далее в течение одной недели инстиллировали окомистин (Miramistin) по 1 капле 2 раза в день. Для исключения риска самопроизвольного травмирования оперированного глаза и занесения инфекции, кроликам одевали специальные воротники.
Методы клинического исследования
Клинические методы исследования включали в себя осмотр глаз кроликов с фокальным освещением и биомикроскопию. Осмотр глаз с фокальным освещением выполняли, используя офтальмоскоп «Heine Beta 200S» («Heine», Германия) на каждом этапе исследования ежедневно в течение всего срока наблюдения.
Биомикроскопическое исследование проводили с помощью офтальмологического биомикроскопа – щелевая лампа «SL-1800» («Nidek», Япония) ежедневно в течение всего срока наблюдения. Различные степени увеличения при биомикроскопии позволяли более детально изучить состояние склеры и роговицы, степень воспалительной реакции.
Толщину роговицы и бельма измеряли методом ультразвуковой пахиметрии на приборе «Compact Touch» (Quantel Medical, Франция).
Оценку состояния глаз проводили по следующим признакам: степени выраженности воспалительной реакции, диаметру дефекта эпителия, степени неоваскуляризации роговицы, интенсивности помутнения роговицы. Степень выраженности воспалительной реакции оценивали по балльной системе Е.В. Ченцовой. Для оценки степени неоваскуляризации роговицы измеряли длину сосудов от лимба к центру роговицы. Интенсивность помутнения роговицы оценивали по шкале Войно-Ясенецкого.
Фоторегистрацию проводили путем фотографирования на фотощелевой лампе фирмы «Opton» (Германия).
Методы гистологического исследования
Морфологическое исследование проводили на кафедре патологической анатомии (заведующий – Заслуженный врач РФ, доктор медицинских наук, профессор О.В. Зайратьянц) ФГБОУ ВО «МГМСУ им. А.И. Евдокимова» Минздрава России. Животных выводили из эксперимента внутривенным введением фенобарбитала. Глаза животных энуклеировали и проводили обработку материала для гистологического исследования. Роговую оболочку вырезали по окружности лимба, а затем фиксировали в 10%-м забуференном нейтральном формалине в течение суток. Полученный диск роговицы разрезали пополам, перпендикулярно по отношению к сосудам. Оба фрагмента стандартным способом обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Срезы толщиной 3 мкм изготавливали на микротоме и окрашивали гематоксилином и эозином. Исследование полученных гистологических препаратов роговицы проводили под световым микроскопом AxioLab A1 с компьютерной программой анализа и фотофиксации изображения (Carl Zeiss Microscopy, Германия).
Исследование биомеханических свойств
Исследование проводили на базе лаборатории биополимеров в НИЦ «Курчатовский институт» под руководством С.В. Крашенинникова. Для исследования биомеханических характеристик вывод животных из эксперимента осуществляли внутривенным введением фенобарбитала. Глаза животных энуклеировали, роговую оболочку вырезали по окружности, захватывая при этом участок склеры, отступая 3 мм от лимба. Для чистоты эксперимента использовали свежевыкроенные ткани животных, полученные непосредственно перед проведением исследования (Рисунок 3А). Полученный диск роговицы зажимали между двух металлических пластин с отверстием 12 мм в центре, соответствующем диаметру роговицы (Рисунок 3Б), таким образом, чтобы фиксация происходила за ткань склеры, а роговица была интактной. Готовую конструкцию опускали в физиологический раствор, чтобы препятствовать высыханию тканей во время исследования (Рисунок 3В).
Биомеханические свойства оценивали, используя масштабированный аналог теста ASTM D5748. Исследование состоит в двухосном нагружении тканей с постоянной скоростью (в нашем случае 1 мм/мин) до прокола. Испытания проводили на универсальной испытательной машине фирмы «Instron» (США) модель 5982 с использованием датчика нагрузки ±50 Н серии 2530. По результатам испытаний определяли максимальную нагрузку (характеризует прочность образцов) и наклон упругой области кривой (характеризует жесткость испытуемого образца). Парные, интактные глаза животных, выведенных из эксперимента, были исследованы по той же методике, для оценки биомеханических свойств нативных роговиц.
