2.4. Методы проведения эксперимента in vivo

     Экспериментально-морфологическое обоснование эффективности и безопасности применения биорезорбируемых антиглаукоматозных дренажей, насыщенных циклоспорином А и эверолимусом проводили на базе биотехнологического центра «БиоТех» и Института экспериментальной медицины и биотехнологии СамГМУ в соответствии с Хельсинкской конвенцией о гуманном обращении с экспериментальными животными (1975 г.), Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986 г.), приказом Минздрава России №199н от 1 апреля 2016 г. «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики». Проведение эксперимента одобрено комитетом по биоэтике при СамГМУ.

    Эксперимент выполнен на 52 глазах половозрелых кроликов породы советская шиншилла весом 3,0-4,0 кг. Животным не выполняли моделирование глаукомы, т.к. традиционные методы моделирования сами по себе воздействуют на оболочки и дренажную систему глаза, провоцируя избыточный рост соединительной ткани на структурах угла передней камеры, либо изначально изменяя интенсивность воспаления и репарации, оцениваемых в ходе исследования. Экспериментальное моделирование глаукомы могло бы исказить полученные результаты и привести к невозможности дифференцировать изменения, вызванные препаратами для моделирования глаукомы, от изменений, вызванных иммунодепрессантами, предлагаемыми для профилактики послеоперационного рубцевания.

    2.4.1. Методы исследования влияния антиглаукоматозного препарата на состояние глазной поверхности лабораторных животных

    Большинство пациентов, направляемых на хирургическое лечение глаукомы, в течение длительного времени находятся на гипотензивной терапии антиглаукоматозными препаратами, которые оказывают значительное влияние на состояние тканей глазной поверхности и ухудшают исходы операции [63, 65, 105, 197]. Поэтому для изучения влияния ЦсА и эверолимуса на процессы послеоперационного рубцевания in vivo в условиях, максимально приближенных к реальной клинической практике, первым этапом лабораторным животным выполняли длительные инстилляции консервант-содержащего комбинированного гипотензивного препарата.

    Группу 1 составили 40 глаз 40 кроликов, которым в течение 3 месяцев до операции выполняли ежедневные однократные инстилляции комбинированного препарата, содержащего β-блокатор тимолола малеат 0,5% и аналог простагландинов латанопрост 0,005%, в состав которого входит консервант бензалкония хлорид в концентрации 0,1 мг/мл (Pfizer, США). Контрольную группу 2 составили 12 глаз 12-ти кроликов, которым ежедневно выполняли инстилляции 0,9% раствора натрия хлорида.

    Кроликам выполняли офтальмологическое обследование, включавшее в себя биомикроскопию на ручной щелевой лампе (SHIN NIPPON XL-1, Япония), пробу Ширмера I с использованием полосок Fluo Strips (Contacare Ophthalmics and Diagnostics, Индия), фоторегистрацию переднего отрезка глаза. Вышеперечисленные исследования проводили непосредственно перед выполнением эксперимента, а также на 14, 28, 60 и 90 сутки.

     Выраженность конъюнктивальной гиперемии оценивали в баллах по шкале от 0 до 3 (Таблица 3). Повреждение роговичного эпителия оценивали по шкале Эфрона после окрашивания роговицы флуоресцеином и биомикроскопии с кобальтовым фильтром (Таблица 4).

    На 90-е сутки проводили гистологическое исследование конъюнктивы, склеры и роговицы 4-х глаз в каждой группе. Вывод животных из эксперимента осуществляли путем передозировки препаратов для наркоза. Для выполнения гистологического исследования глаза животных энуклеировали по следующей методике: выполняли циркулярный разрез конъюнктивы в 1 см от лимба, выделяли и пересекали наружные мышцы глаза, после чего пересекали зрительный нерв у мобилизированного глазного яблока. Удаленное глазное яблоко помещали в раствор нейтрального формалина 10% на 24 часа. Далее для гистологического исследования иссекали блок тканей переднего отрезка, содержащий роговицу, радужку, область лимба и прилежащие оболочки глазного яблока с конъюнктивой и теноновой капсулой. Иссеченный блок тканей подвергали стандартной гистологической проводке и фиксировали в парафине. Гистологические срезы толщиной 6 мкм были изготовлены с помощью микротома (МС-2, Россия). Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, а также альциановым синим по Стидмену с дополнительной окраской ядер гематоксилином Майера. Анализ полученных гистологических препаратов выполняли с помощью системы визуализации на базе микроскопа (Olympus BX 41, Германия) и программы «Морфология 5.2» («ВидеоТесТ», Россия).

    2.4.2. Техника выполнения гипотензивного вмешательства in vivo

    Данный этап исследования выполнен на 36 глазах кроликов из группы 1 предыдущего этапа исследования. Всем животным выполняли модель гипотензивного вмешательства проникающего типа с имплантацией биорезорбируемого пористого дренажа на основе полимолочной кислоты (Рисунок 4). При выполнении вмешательств на глазах контрольной группы имплантировали дренаж, не насыщенный лекарственными препаратами. Глаза группы ЦсА оперировали с применением дренажа, насыщенного циклоспорином А ex tempore, а глаза группы эверолимуса – с имплантацией дренажа, предварительно насыщенного данным препаратом в лабораторных условиях перед стерилизацией. Гипотензивное вмешательство проводили с применением внутримышечного наркоза комбинированным препаратом, содержащим тилетамина гидрохлорид 5% и золазепам 5% (Золетил 100, Virbac Sante Animale, Франция), и ксилазина гидрохлоридом 2% (Рометар, Bioveta, a. s., Чехия) в соответствии с массой животных. Операционное поле обрабатывали 5% раствором повидон-йода (Бетадин, ЭГИС, Венгрия). Разрез конъюнктивы производили параллельно лимбу в 1 мм от него. Конъюнктиву и тенонову капсулу отсепаровывали от подлежащих тканей. Выкраивали склеральный лоскут основанием к лимбу размерами 3 × 3 мм на 2/3 толщины склеры до прозрачных слоев роговицы (Рисунок 5 А, Б). Выделяли и иссекали склеральный блок с трабекулой размерами 0,5 × 3,0 мм. Выполняли базальную иридэктомию. Под склеральный лоскут имплантировали пористый биорезорбируемый антиглаукоматозный дренаж на основе полилактида, выполненный в форме муфты размером 5,2 × 2 мм толщиной 150 мкм. С целью профилактики прорезывания в послеоперационном периоде, дренаж имплантировали длинной осью перпендикулярно лимбу в сложенном состоянии, чтобы дистальная его часть находилась под поверхностным склеральным лоскутом, а проксимальная выходила на поверхность склеры выше склерального лоскута и находилась под конъюнктивой и теноновой капсулой (Рисунок 5 В, Г). При проведении вмешательства кроликам группы ЦсА дренаж предварительно погружали в раствор, полученный из концентрата ЦсА для приготовления раствора для внутривенных инфузий в разведении с BSS в соотношении 1:30 на 15 минут. Перед имплантацией дренаж промокали стерильной фильтровальной бумагой. Кроликам группы эверолимуса имплантировали пористый дренаж на основе полимолочной кислоты, предварительно насыщенный эверолимусом в лабораторных условиях с помощью ультразвукового воздействия (мощность 630 Вт частота 22 кГц) на образец, помещенный в 2% суспензию эверолимуса в физиологическом растворе, в течение 6 минут. Далее дренаж подвергали высушиванию и стерилизации. Кроликам контрольной группы имплантировали пористый дренаж, не содержащий лекарственных препаратов. Поверхностный склеральный лоскут ушивали двумя узловыми швами нитью нейлон 10/0. Разрез конъюнктивы и теноновой капсулы герметично ушивали узловыми швами нитью нейлон 10/0. В оперированный глаз закапывали комбинированный препарат ципрофлоксацина гидрохлорида 0,3% и дексаметазона 0,1% (Комбинил, Sentiss Pharma Pvt. Ltd., Индия) сразу после операции, а также 4 раза в день в послеоперационном периоде в течение 1 недели.

    2.4.3. Методы гистологического исследования зоны операции

     Животных выводили из эксперимента через 7 дней, 1 месяц и после полной визуальной резорбции дренажа (6 месяцев). Выбор данных сроков обусловлен патофизиологическими процессами, протекающими в послеоперационной ране: на 5-7 дни после повреждения наблюдается пик концентрации Т-лимфоцитов, являющихся основными клетками-мишенями действия ЦсА и эверолимуса; через 1 месяц заканчивается клеточная пролиферация и наиболее активная фаза синтеза коллагена, и начинается ремоделирование синтезированной соединительной ткани; исследование тканей после полной резорбции дренажа позволяет изучить послеоперационный рубец на заключительных этапах его формирования. Эвтаназию, энуклеацию глаз и изготовление гистологических срезов производили согласно методике, описанной в разделе 2.4.1 настоящей диссертации. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином, гематоксилином и пикрофуксином по Ван Гизону, гематоксилином и пикросириусом красным. Анализ полученных гистологических препаратов выполняли с помощью системы визуализации на базе микроскопа (Olympus BX 41, Германия) и программы «Морфология 5.2» (ВидеоТесТ, г. Санкт-Петербург, Россия). В статистический анализ включали репрезентативные срезы каждого глаза с визуализацией дренажа в слоях склеры и между теноновой капсулой и эписклерой. Оценивали клеточный состав (мононуклеары, гигантские клетки инородных тел (ГКИТ), гранулоциты, фибробласты) и количество новообразованного коллагена внутри дренажа, толщину и плотность капсулы вокруг дренажа, количество новообразованных кровеносных сосудов, выраженность пространств для оттока ВГЖ. Вышеперечисленные параметры оценивали в баллах по шкале от 0 до 5 согласно межгосударственному стандарту оценки биологического действия медицинских изделий [31].

    2.4.4. Методы послеоперационного обследования животных

    Перед операцией, а также в течение всего послеоперационного периода (на 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 28, 60, 90, 180 сутки) до вывода животных из эксперимента осуществляли офтальмологическое обследование, включавшее в себя биомикроскопию на ручной щелевой лампе (SHIN NIPPON XL-1, Япония), офтальмоскопию с помощью офтальмоскопа (Welch Allyn 11720, США), тонометрию с использованием портативного ветеринарного тонометра Tonovet (Tiolat, Финляндия), фоторегистрацию переднего отрезка глаза. При биомикроскопии оценивали реакцию тканей на оперативное вмешательство, состояние конъюнктивы, морфологию фильтрационной подушки по оценочной шкале фильтрационных подушек университета Индианы (IBAGS), состояние роговицы, передней камеры (ее глубину и прозрачность влаги), радужной оболочки и хрусталика.