2.4 Морфологическое и генетическое исследование опухолевого материала

     Морфологическое исследование материала ТИАБ осуществляли в лаборатории ООО «Евроген Лаб», Москва. Подготовка материала к лабораторным тестам, а также морфологический и генетический анализ материала ТИАБ будет представлено в разделе «Разработка технологии ТИАБ».

    Морфологическое исследование удаленных глаз выполняли по стандартной методике в патогистологической лаборатории ФГАУ «НМИЦ МНТК «Микрохирургия глаза» им. академика С.Н. Федорова» Минздрава России. После извлечения из раствора формалина удаленный глаз промывали проточной водой, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин, выполняли серии гистологических срезов с применением окраски гематоксилин-эозином. Препараты изучали под микроскопом DM LВ2 фирмы «Leica» (Германия) при х50, х100, х200, х400 кратном увеличении с последующим фотографированием.

    Для генетического анализа гистологический материал в виде парафиновых блоков и соответствующих им гистологических стеклопрепаратов передавали в лабораторию ООО «Евроген Лаб» (отдел молекулярной онкологии, руководитель отдела – Зарецкий Андрей Ростиславович, врач-гистолог – к.м.н. Берщанская Александра Мироновна). Предоставленные блоки были перезалиты и использованы для дальнейших исследований без дополнительных диссекционных процедур.

    Гистологические стеклопрепараты, предоставленные вместе с блоками, оценивали на предмет визуального соответствия предоставленным блокам. В случае выявления неполного соответствия с блоков изготавливали новые гистологические стеклопрепараты по стандартной методике. Гистологические стеклопрепараты анализировали методом световой микроскопии. Оценивали наличие опухоли в блоках и основные морфологические параметры, актуальные для характеристики УМ. Для дальнейшего исследования использовали только блоки, признанные информативными, т.е. соответствующими критериям для достоверного молекулярного тестирования опухолевых клеток.

    С каждого из информативных блоков на ротационном микротоме изготавливали не менее восьми срезов толщиной не более 6 мкм. Срезы помещали на стеклопрепараты с адгезивным покрытием из поли-L-лизина (ООО «Апекслаб», Москва, Россия) и инкубировали в течение 3 часов при температуре 56° С.

    Половину изготовленных неокрашенных стеклопрепаратов использовали для проведения молекулярных тестов in situ (методами FISH и ИГХ). Для анализа окрашенных стеклопрепаратов использовали микроскоп BioRevolution BZ-9000 (Keyence Corporation, Осака, Япония).

    Вторую половину изготовленных неокрашенных стеклопрепаратов использовали для выделения ДНК и проведения молекулярных тестов in vitro (методами Супер-АС-ПЦР-РВ и ПЦР с последующим секвенированием продуктов ПЦР). ДНК из образцов выделяли с помощью набора реагентов ExtractDNA FFPE (ЗАО «Евроген», Москва, Россия) в соответствии с инструкцией производителя.

    Контроль концентрации и качества выделенной ДНК осуществляли методом ПЦР-РВ с помощью набора «aXY-Детект» (ООО НПФ «Синтол», Москва, Россия) в соответствии с инструкцией производителя. В качестве контролей использовали три стандартных образца ДНК, изготовленных из фрагментированной геномной ДНК из клеточной линии человека Raji (ЗАО «Евроген», Москва, Россия, кат. № NA102), доведенной с помощью воды бидистиллированной деионизованной (MilliQ – ЗАО «Евроген», Москва, Россия) до финальной концентрации 25, 3,5 и 0,5 нг/мкл. Набор «aXY-Детект» позволяет получить данные о количестве ДНК (канал FAM), определить пол пациента (каналы ROX и VIC), выявить присутствие ингибитора (канал Cy5).

    Пригодными для дальнейшей работы признавали образцы, соответствующие следующим четырем критериям:

    1) Кривые амплификации по всем 4-м каналам имеют стандартную сигмообразную форму;

    2) Рассчитанная концентрация ДНК (по каналу FAM) не ниже 1 нг/мкл (критерий пригодности ДНК для методов ПЦР и ПЦР-РВ) и не ниже 4 нг/мкл (критерий пригодности ДНК для метода MLPA)

    3) XY-статус исследуемого образца (определяемый по наличию амплификации в каналах VIC и ROX) соответствует биологическому полу донора соответствующего биоматериала;

    4) Значение CT по каналу Cy5 не превышает 42 [бОльшие значения допускаются при условии, если рассчитанная концентрация ДНК (по каналу FAM) превышает 20 нг/мкл].

    Поиск мутаций в «горячих точках» генов GNAQ (экзоны 4 и 5) и GNA11 (экзоны 4 и 5) в ДНК проводили в два этапа. На первом этапе осуществляли поиск трех наиболее часто встречающихся мутаций – c.626A>T, p.(Gln209Leu) в экзоне 5 гена GNA11, c.626A>T, p.(Gln209Leu) и c.626A>C, p.(Gln209Pro) в экзоне 5 гена GNAQ – методом высокочувствительной мутационно-специфической ПЦР-РВ в модификации усиленной аллель-специфической ПЦР-РВ с одновременным подавлением амплификации аллелей «дикого типа». При отсутствии этих трех мутаций на втором этапе проводили поиск редких мутаций в «горячих точках» экзонов 4 и 5 гена GNA11 и экзонов 4 и 5 гена GNAQ методом ПЦР с последующим секвенированием продуктов ПЦР. Поиск мутаций в «горячих точках» генов EIF1AX (экзоны 1 и 2), SF3B1 (экзон 14) и SRSF2 (экзон 1) в ДНК проводили методом ПЦР с последующим секвенированием продуктов ПЦР.

    Количество копий короткого плеча хромосомы 1 (1p), короткого плеча хромосомы 3 (3p), длинного плеча хромосомы 3 (3q), короткого плеча хромосомы 6 (6p), длинного плеча хромосомы 6 (6q), короткого плеча хромосомы 8 (8p) и длинного плеча хромосомы 8 (8q), а также количество копий гена BAP1 в ДНК оценивали методом мультиплексной амплификации лигированных зондов (MLPA). Использовали набор реагентов «Uveal Melanoma Probemix» (MRC Holland, Нидерланды) в соответствии с инструкцией производителя. Математическую обработку результатов проводили в три этапа в соответствии с рекомендациями производителя набора реагентов. Финальную интерпретацию результатов проводили на основе данных после двух раундов нормализации (т.е. опираясь на значения параметра Final Ratio) в соответствии с таблицей 2.1.

    Уровень экспрессии белка BAP1 оценивали иммуногистохимическим методом на автоматическом стейнере закрытого типа Benchmark XT (Ventana – Roche, Великобритания) с использованием моноклонального антитела C-4 (anti-BAP1; Santa Cruz Biotechnologies, США) в соответствии с инструкциями производителей. Учитывали только ядерное окрашивание в опухолевых клетках. Уровень экспрессии белка BAP1 оценивали в соответствии с процентом позитивных опухолевых клеток (высокий уровень экспрессии – ≥ 80% позитивных опухолевых клеток; средний уровень экспрессии – более 20, но менее 80% позитивных опухолевых клеток; низкий уровень экспрессии – более 1%, но не более 20% позитивных опухолевых клеток; экспрессия не обнаружена – не более 1% позитивных опухолевых клеток).