2.4. Цитотоксичность криоконсервированного лентикулярного материала после децеллюляризации в присутствии кератоцитов

    Выделение кератоцитов человека и их культивирование

     Для получения первичной культуры клеток кератоцитов использовали строму РСД без переднего эпителия и десцеметовой мембраны. РСД как источник клеточного материала для экспериментальной работы был предоставлен ГТБ головной организации ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Фёдорова» Минздрава России (заведующая, к.м.н., М. Х. Хубецова) с соблюдением всех действующих протоколов в рамках законодательства РФ. Возраст донора составлял 58 лет, время от момента смерти составляло 16 часов, показатели трансплантабельности кадаверного материала по Борзенку С.А. – 3 А и В [4].

    Для выделения первичной культуры клеток кератоцитов использовали кусочки стромы РСД, полученные путем ее разделения гистологическим лезвием на 8 равных частей. Затем проводили ферментативную дезагрегацию кусочков стромы роговицы. Для этого фрагменты переносили в пробирку типа Эппендорф и добавляли 1 мл DMEM/F12 и коллагеназы II типа в концентрации 10 мг/мл. Далее пробирку типа Эппендорф помещали в центрифугу SL-40 R (Thermo Scientific, Германия), с использованием следующих параметров: 1800 об/мин при температуре + 37 °С в течение 20 мин. Полученные фрагменты переносили в чашки Петри (35 мм) и заливали питательной средой, состоящей из 89% DMEM/F12 (Sigma Aldrich, Канада), 10% Эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США) (FBS), 1% смеси антибиотиков (MP Biomedicals, США) и 0,1 ммоль/л Аскорбиновой кислоты (ПанЭко, Россия).

    Культивирование клеток стромы роговицы проводили в стандартных условиях (при температуре +37°С, 5% СО₂, влажность 95%) в инкубаторе NU-5510 (Nu-Aire, США). При достижении 80% уровня конфлуэнтности клетки пассировали. Полную смену питательной среды проводили раз в три дня. Визуальный контроль роста клеток осуществлялся с помощью инвертированного светового фазово-контрастного микроскопа Olympus IX-81. Для получения необходимого количества клеток (2 млн.) культуру пассировали в чашках Петри (100 мм) до получения культуры клеток 3-4-го пассажа по стандартной схеме [26].

    Для экспериментальной работы культуру клеток извлекали из чашки Петри. Для этого в ней заменяли питательную среду на 0,25% раствор Трипсина - ЭДТА и раствор Версена (в соотношении 1:1) и инкубировали в стандартных нормотермических условиях в течение 5 минут; полученную суспензию клеток переносили в центрифужную пробирку и центрифугировали в режиме 1800 об/мин при температуре +37°С (5 мин), супернатант удаляли аспиратором. Осадок разбавляли в 1 мл питательной среды с FBS и переносили в 15 мл пробирку (Corning, США). Подсчет клеток в суспензии проводили с помощью автоматического счетчика клеток Luna II (Logos biosystems, Корея), после чего данную суспензию разбавляли питательной средой чтобы получить необходимую концентрацию клеток (20 тыс. клеток в 1 мл питательной среды).

    Тест «Live and Dead»

    Оценку жизнеспособности полученной культуры клеток в присутствии ДЛМ после криоконсервации проводили с помощью проточного цитофлуориметра. Для этого образцы окрашивали флуоресцентным красителем «Live and Dead» (Abcam, Великобритания). Тест «Live and Dead» является коммерческим набором, состоящим из двух флуоресцентных красителей: живые клетки – зеленый цвет (Ex.494; Em.515), мертвые клетки–красный цвет (Ex.528; Em.617).

    В рамках данного исследования на этапе пассирования отбирали пробу с плотностью клеток 1х10⁵/см². В исследовании было использовано 3 образца, которые переносили по одному на дно каждой лунки 24-луночного планшета (Costar, США). Затем сверху добавляли питательную среду, содержащую суспензию клеток плотностью 1х10⁵/см² и инкубировали 3 суток при температуре +37°С. Для контроля роста клеточной культуры в 3 пустые лунки планшета вносили суспензию клеток с питательной средой (1х10⁵/см²). Инкубация проходила в течение 3 суток (t +37°С).

    Через 3 суток из планшета аспиратором отбирали питательную среду с клетками, добавляли в лунку с ЛМ 0,25% раствор Трипсин-Версена (1:1). Далее проводили инкубацию при температуре +37°С (5 мин). После того, как при визуальном подтверждении убеждались, что клетки отошли от пластика планшета, их забирали пипеткой и переносили в 15 мл пробирку и центрифугировали в режиме 1200 об/мин при температуре +37°С (5 мин). Надосадочную жидкость удаляли аспиратором, в полученный осадок добавляли 1 мл питательной среды. Из пробирки удалялся ЛМ.

    Далее пробирку со смесью центрифугировали (1100 обор/мин в течение 5 мин), надосадочную жидкость удаляли и добавляли раствор Cell Wash (BD, США) в обьеме 1 мл. Затем их повторно центрифугировали (1100 обор/мин, в течение 5 мин) и полученный осадок разбавляли в 100 мкл раствора PBS с 1% раствором «Live and Dead». Инкубация проходила в темноте при комнатной температуре в течение 10 минут. Анализ осуществлялся с помощью проточного цитофлуориметра Cyto Flex (Beckman Coulter, США) (Рисунок 10).

    Метод «ДНК-комет»

     Метод «ДНК-комет» позволяет определить повреждение ДНК вследствие возможного токсического воздействия ДЛМ после криохранения на клетки стромы. В основе метода лежит регистрация разной подвижности поврежденной ДНК индивидуальных лизированных клеток в агарозном геле при постоянном действии электрического поля. При этом происходит миграция ДНК к аноду, с последующим образованием электрофоретического следа, который визуально напоминает «хвост кометы». Ее параметры зависят от степени повреждения ДНК.

    Подготовительный этап включал в себя подготовку 24-луночного планшета, в 3 лунки которого вносили суспензию клеточной культуры с питательной средой, предварительно облученной ультрафиолетом (10 минут) – Контроль UV. Данный показатель демонстрирует уровень максимально возможной гибели кератоцитов.

    Далее помещали 3 образца, по одному в каждую лунку и питательную среду с культурой кератоцитов плотностью 1х10⁵/см². В другие 3 лунки вносили только суспензию с клеточной культурой и питательной средой. Планшет с образцами инкубировали 3 суток при температуре +37°С. Затем через 3 суток питательную среду с клетками убирали и добавляли в каждую лунку планшета 0,25% раствор Трипсина-Версена (1:1). Далее проводили инкубацию в течение 5 минут при температуре +37°С. Затем полученную суспензию с образцами переносили в 15 мл пробирку и центрифугировали (1200 обор/мин, 5 мин, t +37°С), надосадочную жидкость убирали, а полученный осадок разбавляли в 1 мл питательной среды. ЛМ убирали из планшета. Пробирку со суспензией переносили на предметные стекла, покрытые слоем агарозы и охлаждали при температуре +4°С в течение 10 минут. Затем образцы переносили в лизирующий раствор (2,5 М NaCl, 10мМ Трис, 100мМ ЭДТА). Инкубацию проводили в течение 1 часа при температуре +4°С. Таким образом, полученные препараты помещали в щелочной раствор (рН>13) с последующим проведением электрофореза (1В на 1 см, 20 мин), для нейтрализации использовали раствор PBS (pH-7.4). Окрашивание препаратов проводили с помощью раствора этидиума бромида в дистиллированной воде, в темных условиях с экспозицией 2 часа при температуре +4°С.

    Препараты анализировали с помощью лазерно-сканирующего конфокального микроскопа Olympus FV 10i (Olympus,Япония). Для анализа полученных изображений использовали встроенное программное обеспечение микроскопа.

    Изображения ДНК- комет разделили на 5 условных типов. Данное разделение требуется, чтобы получить количественные данные. Индекс ДНК – комет рассчитывали с помощью математической формулы: где I_dc– индекс ДНК-комет, n₀до n₄– количество ДНК-комет каждого типа, Σ -общая сумма ДНК-комет

    МТТ – тест

    МТТ тест – колориметрический анализ выживаемости клеток, позволяющий в данных условиях культивирования клеток проводить оценку их метаболической активности. Метод основан на способности митохондриальных дегидрогеназ живых клеток превращать водорастворимый желтый 3-(4,5-диметилтиазолин-2)-2,5дифенилтетразолий (МТТ) бромид в фиолетовые нерастворимые в воде кристаллы формазана. Далее органические растворители (изопроналол или диметилсульфоксид) переводят фиолетовые кристаллы формазана в растворенное состояние и по интенсивности окрашивания и оптической плотности раствора судят о количестве жизнеспособных клеток, которые определяются с с помощью метода спектрофотометрии.

    В начале исследования 3 образца с помощью гистологического лезвия измельчали (размер фрагментов ЛМ около 1 мм). Затем полученные измельченные фрагменты образцов в равном объеме переносили на дно 3 лунок 24-луночного планшета. Далее сверху добавляли питательную среду, содержащую культуру клеток кератоцитов плотностью 20.000 клеток на лунку – опыт. В отдельные 3 лунки планшета была добавлена питательная среда с культурой клеток кератоцитов (плотность = 20.000 клеток на лунку) – контроль. Далее планшет инкубировали в течение 1 суток при температуре +37°С. Затем измеряли оптическую плотность контроля и опыта с помощью спектрофотометра Multiskan GO (Thermo Scientific, США) при длинах волн 570 нм и 620 нм. Данные спектрофотометра рассчитывались по следующей формуле:

    Е = А570-А620, где Е – оптическая плотность, А570 – значение при длине волны 570 нм, А620 – значение при длине волны 620 нм

    Количество жизнеспособных клеток (Nж) рассчитывается следующим образом: Nж= Еопыта/Eконтроля

    Через 1 сутки планшет доставали из инкубатора и помещали в Ламинарный бокс II класса безопасности. С помощью дозатора убирали полученную смесь из планшета. Смесь промывали в растворе PBS (рН 7,4). В каждую лунку планшета добавляли 300 мкл МТТ–бромида с концентрацией 0,25 мг/мл в FBS. Планшет с экспериментальной смесью и красителем помещали в инкубатор NU-5510 (Nu-Aire, США) на 30 минут, после этого среду с МТТ-бромидом убирали, в каждую лунку с экспериментальной смесью добавляли изопропанол-2. После инкубации смеси с изопропанолом-2 в течение 10 минут проводилось измерение оптической плотности спектрофотометром в соответствии с вышеприведенной формулой. Анализ данных проводился на 1, 3, 5, 7 и 9 сутки.