2.5. Подготовка и применение криоконсервированного лентикулярного материала для интрастромальной кератофакии

    Дегидратирующие возможности разных вискоэластиков на толщину криоконсервированного лентикулярного материала

     Известно, что процессы децеллюляризации и криоконсервации ЛМ вызывают неспецифический отек ткани. В связи с данным фактом актуальным является поиск дегидратирующей среды, способной вернуть исходную толщину ЛМ. В данной работе для дегидратации были использованы две среды:

    1. Дисперсный вискоэластик (ДВ), массой 600.000 Дальтон, в состав которого входит и 3,0% гиалурoнат натрия и 4,0% хондроитин сульфат

    2. Когезивный вискоэластик (КВ), массой 2.500.000 Дальтон, содержащего 1,0% гиалурoнат натрия

    Образцы помещали в отдельные пробирки типа Эппендорф, содержащие 1 мл ДВ и 1 мл КВ. Данные параметров толщины образцов были получены с помощью метода оптической когерентной томографии iVue 100 (Optovue, США). Данные из прибора оптической когерентной томографии (ОКТ) собирались 1 раз после криоконсервации децеллюляризированного ЛМ и 6 раз (каждые 10 минут в течение 1 часа) после добавления вискоэластиков к образцам. (Таблица 8). В качестве исходной толщины ЛМ служили данные, полученные из лазера при проведении операции СМАЙЛ.

    Образцы сначала помещали и центрировали на жесткой газопроницаемой контактной линзе (ЖГЛ), с последующей фиксацией ЖГЛ к искусственной передней камере глаза (ИПК). Затем ИПК оставляли на горизонтальной поверхности стола. Линзу прибора ОКТ устанавливали перпендикулярно поверхности ЛМ (Рисунок 11). Возможность такого расположения головной части прибора ОКТ позволило без затруднений проводить пахиметрию образцов. Регистрировались значения толщины ЛМ в центре (место наибольшей толщины образца). Исследование проводилось с помощью программы Cross-Line Raster.

    Дизайн экспериментального исследования ex vivo имеет следующий вид:

    1. Отбор кадаверных глаз

    2. Имплантация ЛМ в строму роговицы кадаверных глаз

     Отбор кадаверных глаз

    Характеристика донорского материала

    Для экспериментальных исследований в данной работе использовался донорский материал – кадаверные глаза (n=10).

    При заборе и заготовке кадаверных глаз человека для целей трансплантации и научных исследований, руководствовались специальным разрешением и официально принятыми процедурами в рамках законодательства РФ, на основании лицензии Федеральной государственной службы по надзору за Здравоохранением от 30.04.2008 № 99-01-005317 и от 18.02.2013 № ФС-99-01-008251 ГТБ ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургии глаза» им. С.Н. Федорова» Минздрава России.

    Согласно установленному режиму работы кадаверные глазные яблоки поступают в ГТБ головной организации ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургии глаза» им. С.Н. Федорова» Минздрава России из танатологических отделений Бюро судебно – медицинской экспертизы согласно действующему договору. Данные о возрасте, поле доноров и времени их смерти были предоставлены ответственным сотрудником Бюро судебно - медицинской экспертизы.

    Перед введением кадаверного глаза в эксперимент проводилась серологическая диагностика трупов-доноров на инфицированность вирусами ВИЧ I/II, гепатитов В и С, RW, в условиях микробиологической лаборатории головной организации ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургии глаза» им. С.Н. Федорова» Минздрава России по образцам венозной крови, поставляемым вместе с тканями глазных яблок от доноров–трупов. После прохождения проверки на инфекционную безопасность, сотрудником ГТБ проводилась оценка морфологического показателя трансплантабельности по Борзенку С.А. [4].

    Для выполнения экспериментального исследования кадаверные глаза отбирали по следующим критериям: средний возраст доноров до 58 лет, время от момента смерти до имплантации ЛМ не более 16 часов, показатели адреналиновой пробы – С, морфологический показатель 3 по классификации Борзенка С.А. [4]. Предварительно в условиях операционного бокса под ламинаром (Ламинарный бокс I класса безопасности Frontron L-F (Pokrok vyrobne druzstvo Zilina (Чехословакия)) проводили удаление отечного переднего эпителия с помощью роговичного скребца-скарификатора с соблюдением всех норм стерильности. Далее деэпителизированный кадаверный глаз помещали в стерильный флакон, содержащий 30 мл «Раствора для хранения роговицы» (среда Борзенка-Мороз) (ООО НЭП «Микрохирургия глаза», Москва) и переносили в контейнере в отдел лазерной рефракционной хирургии и операционный блок головной организации головной организации ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургии глаза» им. С.Н. Федорова» Минздрава России, где проводились морфометрические исследования роговицы кадаверного глаза до- и после имплантации ЛМ в ее строму. Вместе с кадаверными глазами транспортировались также заранее подготовленные пробирки типа Эппендорф, содержащие ЛМ в 1 мл раствора PBS и пробирки, содержащие 1 мл ДВ без ЛМ.

    Имплантация лентикулярного материала в строму роговицы кадаверных глаз

     В условиях операционного блока зафиксированный в держателе глаз устанавливали в проекции головки лазера (Рисунок 12). Предварительно подготовленный ЛМ в 1 мл PBS переносили в пробирку типа Эппендорф с ДВ за 30 минут до начала процедуры формирования клапана.

    С помощью фемтосекундного лазера FS200 WaveLight (Alcon, США) для формирования клапана были выбраны следующие параметры: энергия излучения 0,8 мкДж, частота повторения 200 кГц, длительность импульса 350 фемтосекунд, ширина канала 1,5 мм, угол бокового разреза 90°, диаметр клапана 9,0 мм, толщина клапана 130 мкм (Рисунок 13). После завершения процедуры клапан откидывали. ЛМ извлекали из пробирки с ДВ, помещали на ватный тупфер и под визуальным контролем микроскопа расправляли его на тупфере передней поверхностью вверх. Ориентиром передней поверхности образца был узел шовного материала, расположенный на его периферии. После расправления ЛМ данный шовный узел отсекали микроножницами. Далее его переносили на стромальное ложе роговицы, сохраняя при этом ориентацию лентикулы передней поверхностью вверх и центрировали ее относительно зрачка. Клапан возвращали на исходное место. В конце процедуры с помощью ватного тупфера производили разглаживание поверхности роговицы кадаверного глаза.

    Морфометрические особенности изменения роговицы до- и после имлантации лентикулярного материала в строму роговицы

    Морфометрические исследования проводились до- и после имплантации ЛМ в строму роговицы с помощью следующих методов: оптическая когерентная томография (ОКТ), компьютерная топография роговицы (Pentacam). Для экспериментального исследования ex vivo было использовано 10 кадаверных глаз и 10 образцов лентикулярного материала. ЛМ (n=10) был получен при коррекции миопии среднее значение которого составляло -4,6± 0,96 дптр.

    Лентикулярный материал извлекали из сосуда Дьюара, где они хранились в жидком азоте при температуре – 196°С. Далее после их размораживания на водяной бане при температуре +37°С проводили цикл отмывания, описанный в главе 2.3.1.

    Срок от момента хранения образцов до их использования составлял от 7 до 21 суток. В день эксперимента образцы, помещенные в пробирку типа Эппендорф с раствором 1мл PBS вместе с кадаверными глазами, были помещены в контейнер с дальнейшей их транспортировкой в отдел лазерной рефракционной хирургии и операционный блок головной организации ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургии глаза» им. С.Н. Федорова» Минздрава России. Помимо этого, в день эксперимента заранее были подготовлены пробирки с 1 мл ДВ. Для эксперимента использовались образцы (n=10), полученные при сферической коррекции миопии после операции СМАЙЛ.

    Измерение параметров толщины ЛМ и роговицы кадаверных глаз осуществлялось в области центральной оси с помощью оптического когерентного томографа RTVue 100 (Optovue, США).

     Компьютерную кератотопографию осуществляли с использованием анализатора переднего сегмента глаза Pentacam (Occulus, Германия). С помощью кератотопографических карт (4 Maps Refractive) проводили анализ сагиттальной кривизны (передней поверхности) роговицы кадаверного глаза значений Km в пределах 7-миллиметровой зоны (дптр).

    На этапах до- и после имплантации ЛМ в роговицу кадаверного глаза добивались достижения состояния клинической нормотензии с помощью вращения винта на держателе (Экспериментально-техническое производство «Микрохирургия глаза», Россия), в котором был зафиксирован трупный глаз (тонометрия по Маклакову около 15 мм.рт.ст.).