2.5. Техника выкраивания ультратонкого трансплантата из консервированных донорских роговиц методом задней автоматизированной послойной кератопластики

    Роговицы контрольной (n = 6) и опытной (n = 6) групп консервировали при + 4⁰С в течение 4-х суток в двух средах – базовой и собственной рецептуры. После консервации из роговиц обеих групп под контролем оптического когерентного томографа (Optovue, iVue 100, США) формировали ультратонкие задние послойные трансплантаты с использованием микрокератома (Moria, Франция) путем одинарного прохода режущей головкой.

    По окончанию формирования ультратонкого заднего послойного трансплантата проводили морфофункциональное исследование жизнеспособности эндотелиальных клеток с использованием флуоресцентного красителя «Live and dead» (Abcam, Великобритания). Для этого образцы однократно промывались раствором PBS, далее образцы переносили в чашки Петри и размещались эндотелием вверх, добавляли 200 мкл 10-кратного раствора красителя на 10 мин., далее удаляли краситель 3-х кратным отмыванием в PBS. Все манипуляции проводили в темное помещение при комнатной температуре. Исследование образцов проводили с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (Olympus FV 10i, Япония).

    Для оценки ультраструктуры эндотелиального клеточного слоя, ориентации и повреждения коллагеновых волокон стромы, а также профиля среза образцы обеих групп подвергались пробоподготовке для электронной микроскопии. Полученные образцы исследовали с использованием растрового электронного микроскопа (JEOL JCM-6000, Япония)