2.6. Лабораторные методы исследования

     Все манипуляции с клеточными культурами проводили в стерильных условиях ламинарных боксов II класса безопасности. В таблице 2 перечислено используемое в работе оборудование.

    Для гистологических исследований материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, промывали проточной водой, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин.

    Выполняли серии гистологических срезов с применением окраски гематоксилин-эозином. Препараты изучали под микроскопом Leica DM LВ2 с камерой DFC-320 при 50х и 200х кратном увеличении с последующим фотографированием. Световая микроскопия полученных образцов была выполнена в Лаборатории патологической анатомии и гистологии глаза ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им акад. С.Н. Фёдорова» МЗ России, Москва (зав. лабораторией - к.м.н. Шацких А.В.).

    Клеточное и органотипическое культивирование, конфокальную и сканирующую электронную микроскопию проводили в Центре фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им акад. С.Н. Фёдорова» МЗ России, Москва (зав. центром - д.м.н., проф. Борзенок С.А.).

    Для подготовки образцов к сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) роговично-склеральные диски извлекали из фиксирующего раствора (10% формалин), далее с помощью вакуумного трепана Barron (Katena, США) диаметром 6 мм выкраивали сквозной роговичный диск. Затем проводили два разреза на роговице по краю сформированного роговичного кармана для вскрытия его полости. После этого одним пинцетом фиксировали часть выкроенного диска со стороны Десцеметовой мембраны, а другим – край роговичного клапана и производили раскрытие с отсечением «крышки» и обнажением «ложа» роговичного кармана. После вскрытия данного кармана во всех исследуемых группах изучали поверхность имплантированной ОПК, поверхностные слои - «крышки» и стромального «ложа» роговицы. На этапе подготовки образцов применяли методику обезвоживания с использованием ацетоновой батареи (10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 90%, 100%) 3х-кратно по 10 минут в каждом растворе с последующим вакуумным высушиванием в критической точке (K850 Critical Point Dryer, Quorum, Великобритания).

    Далее все образцы фиксировали на алюминиевых предметных держателях (по одному для каждого образца) с помощью карбонового скотча таким образом, чтобы исследуемая поверхность стромы роговицы была обращена вверх. После фиксации производили напыление образцов золотом (проба 999, толщина слоя 5 нм) на установке JEOL Company Smart Coater (Япония) для создания электронно-проводящего слоя на поверхности исследуемых объектов. Затем образцы помещали в камеру двулучевого сканирующего электронного микроскопа JCM-6000 PLUS (JEOL Company, Япония) и анализировали в условиях высокого вакуума при ускоряющем напряжении 10 кВ при увеличениях 20, 100, 400, 1000, 2000х.