Рисунок 1 – Иммуноцитохимический анализ культуры клеток ретинального пигментного эпителия на первом пассаже. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, ядра ДНК (Hoechst, синее свечение). Увеличение X 600 А – в клетках превалирует экспрессия цитоплазматического маркера RPE -65 (зеленое свечение); Б – в единичных клетках в культуре на мембране точечно локализовался маркер плотных контактов ZO-1(зеленое свечение); В - слабая экспрессия активатора процесса ЭМТ Snail + Slug (зеленое свечение);
Рисунок 2 – Иммуноцитохимический анализ культуры клеток ретинального пигментного эпителия на третьем пассаже. Иммуноцитохимическое окрашивание, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, ядра ДНК (Hoechst, синее свечение). Увеличение X 600 А – увеличение экспрессии активатора процесса ЭМТ Snail + slug (зеленое свечение); Б – появление в культуре клеток α-SM актина (зеленое свечение) и виментина (красное свечение);
3.1.1. Иммуноцитохимическая характеристика 2D модели культуры клеток ретинального пигментного эпителия первого пассажа
В исследовании на культуре клеток РПЭ первого пассажа (Р1) был выявлен индуктор ЭМТ: Snail + Slug.
Рисунок 3 – Иммуноцитохимический анализ культуры клеток ретинального пигментного эпителия на пятом пассаже. Иммуноцитохимическое окрашивание, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, ядра ДНК (Hoechst, синее свечение). Увеличение X 600 А – выраженная экспрессия активатора процесса ЭМТ Snail + Slug (зеленое свечение); Б – выраженная экспрессия в культуре клеток α-SM актина (зеленое свечение) и виментина (красное свечение);
Рисунок 4 – Экспрессия маркера Snail + Slug на Р1, Р3, Р5
3.1.2. Иммуноцитохимическая характеристика 2D модели культуры клеток ретинального пигментного эпителия третьего пассажа
В исследовании на культуре клеток РПЭ третьего пассажа (Р3) были выявлены маркеры и индуктор ЭМТ: виментин, α-SM актин, Snail + Slug.
В культуре РПЭ Р3 наблюдалось изменение клеточной морфологии. Выявлены изменения профиля экспрессии маркеров в сторону мезенхимального фенотипа. Экспрессия маркеров RPE65 и ZO-1 не выявлялась, что обусловливало полную трансдифференцировку клеток в мезенхимальный фенотип. В то же время нарастала экспрессия Snail + Slug (Рисунок 2 А). В данном пассаже выявлены клетки, экспрессирующие виментин, который является маркером начальной стадии эпителиально-мезенхимальной трансформации. Его появление указывало на перестройку цитоскелета клетки, влекущую последующее изменение её функции [189]. Также в образцах был обнаружен α-SMА - маркер дифференцировки гладкой мускулатуры и активированных фибробластов. Его наличие подтверждало переход данных клеток в мезенхимальный фенотип, указывало на прогрессирование пролиферативного процесса и процесс трансформации (Рисунок 2 Б). Клетки, экспрессирующие α-SMА проявляют сократительную активность [45, 129, 189]. Перечисленные наблюдения указывали на проявления и нарастания феномена эпителиально-мезенхимальной трансформации клеточной культуры.
3.1.3. Иммуноцитохимическая характеристика 2D модели культуры клеток ретинального пигментного эпителия пятого пассажа
В исследовании на культуре клеток РПЭ пятого пассажа (Р5) было отмечено усиление экспрессии маркеров и индуктора ЭМТ: виментин, α-SM актин, Snail + Slug.
В культуре РПЭ пассажа P5 выявлено нарастание экспрессии маркеров мезенхимального фенотипа Snail + Slug (Рисунок 3 А), виментина, α-SM актина (Рисунок 3 Б), что обусловлено нарастанием пула миофибробластоподобных клеток и прогрессированием эпителиально-мезенхимальной трансформации клеточной культуры.
Рисунок 5 – Экспрессия маркера α-SM актин, виментин в Р1, Р3, Р5
Рисунок 6 – Экспрессия маркера RPE 65 в Р1, Р3, Р5
В Р1 пассаже экспрессия виментина и α-SM актина не выявлена. При сравнительном анализе Р3 и Р5 между экспрессией виментина статистически значимой разницы не выявлено (р>0,05), однако выявлена статистически значимая разница экспрессии α-SM актина, данный маркер нарастает в Р5, что говорило об увеличении количества миофибробластоподобных клеток (р<0,05) (Рисунок 5). Отсутствие специфических маркеров РПЭ (RPE 65, ZO – 1) на Р3 и Р5 также подтверждало полную трансформацию клеток в мезенхимальный фенотип и потерю ими свойств эпителиальных клеток (Рисунок 6, 7).
Таким образом, проведенное экспериментальное исследование показало переход эпителиальных клеток в мезенхимальный фенотип путем процесса ЭМТ. При этом в клетках изменялась экспрессия большого числа белков: маркеров (виментина и α-SM актина), указывающих на активацию процессов и его регуляторов (Snail + Slug), непосредственно участвующих в осуществлении программирования процесса ЭМТ. В исследовании наблюдали перестройку клеточного состава, что выражалось в увеличении экспрессии вышеперечисленных специфических маркеров и регуляторов клетками. Следует отметить, что эпителиально - мезенхимальный переход позволял клетке находиться в промежуточном мезенхимальном состоянии с прогрессирующим нарастанием мезенхимальных признаков, что было продемонстрировано в исследовании. Было подтверждено, что ЭМТ является механизмом фибротического ремоделирования тканей.
