Рисунок 3.1 - Схематический вид тонкостенных (А) и обычных (В) инъекционных игл
Рисунок 3.2 - Вид тонкостенных (А) инъекционных игл в сравнении с обычными (В)
Для разработки технологии ТИАБ ее выполняли на 71 энуклеированном глазу с клинически и инструментально установленным диагнозом УМ, при котором невозможно было провести органосохраняющее лечение ввиду больших размеров очага, вторичных изменений и отказа пациента от сохранения глаза. ТИАБ проводили непосредственно после завершения операции энуклеации. В 50 случаях УМ имела хориоидальную локализацию, в 20 – цилиохориоидальную, в 1 – цилиарную. Средняя высота опухоли в экспериментальной группе составила 10,6 мм, диапазон от 4,8 мм до 19,4 мм. Средняя протяженность образования составила 15,2 мм, диапазон от 8,8 мм до 20,6 мм. Вторичная отслойка сетчатки имела место в 64 случаях. Средняя высота отслойки сетчатки составила 4,2 мм, диапазон от 1,18 мм до 12,6 мм.
3.1.1. Разработка хирургической техники и оптимального инструментария ТИАБ внутриглазных образований
ТИАБ в экспериментальной группе выполняли двумя доступами на одном и том же глазу – трансвитреальным (n=71) и транссклеральным (n=71).
Выбор доступа определяли исходя из локализации опухолевого очага, а также наличия вторичных изменений. Оптимальной при постэкваториальной локализации образования при условии адекватной визуализации опухолевой ткани считали трансвитреальную ТИАБ, при преэкваториальной – транссклеральную. Выбор трансвитреального доступа для опухолей задней локализации объясняется удобством выполнения манипуляции, меньшей травматичностью и возможностью контроля склерального канала в отсроченном периоде, что исключено при проведении транссклеральной ТИАБ образований центральной локализации [231]. В случаях ТИАБ УМ преэкваториальной локализации, подразумевающих одномоментное проведение брахитерапии, предотвращающей возможный рост опухоли по склеральному каналу [45, 117, 231], целесообразно использовать транссклеральный доступ.
На первом этапе работы ТИАБ выполняли инъекционными стерильными иглами однократного применения 25-27G. Было отмечено, что при опухолях проминенцией менее 3мм отмечается неполное погружение острия иглы в ткань опухоли и выстояние верхней части аспирирующего окна над поверхностью сетчатки. Это являлось причиной аспирации стекловидного тела в процессе забора опухоли, что приводило к появлению гипотонии. Кроме того, отмечали подтягивание сетчатки в просвет иглы, что в ряде случаев приводило к ее отслойке. Для решения данной проблемы было предложены иглы 25-27G длиной от 25 до 39 мм с различными углами заточки косорезанного рабочего конца (Заявка №2020109301 от 03.03.2020г). Значения угла среза составили 30-60 °с шагом в 15 °: 30°, 45° и 60°. При этом угол среза рабочего конца иглы выбирается в зависимости от высоты внутриглазного образования: при высоте образования до 3 мм выбирают угол среза 60°, при высоте образования от 3 мм до 5 мм угол среза составляет 45°, при высоте опухоли более 5 мм - 30° (см.табл.3.1). Для повышения информативности материала ТИАБ было также предложено уменьшить толщину стенки трубки иглы при сохранении калибра наружного диаметра игл 25-27G (рис.3.1 и рис. 3.2). Тонкостенные иглы изготавливались из трубки с внутренним диаметром 0,28-0,38 мм. Уменьшение толщины стенки разработанных игл, а также различные углы заточки, позволили увеличить площадь аспирирующей поверхности иглы. Параметры разработанных игл и их сравнение с инъекционным представлено в таблице 3.1.
При этом в процессе выполнения ТИАБ предложенными иглами с разными углами заточки обращали внимание на то, что при выполнении забора иглами 27G получали сомнительный материал при опухолях малой проминенции. Однако при выполнении ТИАБ очагов малой проминенции (до 3мм) иглами 25G отмечали удовлетворительный макроскопически материал биопсии. Данное наблюдение легло в основу более частого использования игл 25G при биопсии очагов малого размера.
С целью повышения информативности были также разработаны иглы с косорезанным рабочим концом (рис.3.3.), имеющим продолжение на противоположной острию иглы части трубки в виде прорези (Патент РФ № 2017138224). Прорезь, согласно изобретению, берет свое начало от косорезанного рабочего конца иглы в виде прямоугольника, оканчивающегося полукругом. Боковые стороны прорези имеют протяженность 2мм, ширину – 1мм, а все кромки заточены под углом 30-35 градусов к оси иглы. Наличие дополнительной прорези увеличивает площадь аспирирующего окна, а заточенные кромки вырезки позволяют при ротационном движении иглы в процессе ТИАБ «режущим» движением отсечь ткани внутриглазного образования, оказавшиеся в просвете иглы.
Иглу соединяли с пустым стерильным шприцем 3-5мг посредством мягкой трубки-проводника. Использование трубки-проводника обеспечивает большую свободу руки хирурга, что позволяет более тонко проводить манипуляцию, в отличие от прямого соединения шприца с иглой. Кроме того, по завершении аспирации на мягкую трубку проводник необходимо накладывать зажим для предотвращения аспирации сетчатки и стекловидного тела, происходящей при извлечении иглы из опухоли - при переходе иглы из более плотной среды (ткани опухоли) в менее плотную – стекловидное тело.
Пережатие трубки блокирует отрицательное давление, создаваемое шприцем. Трансвитреальную ТИАБ выполняли на 71 энуклеированном глазу. С учетом существующих данных о возможной имплантации опухолевых клеток в склеральный канал при стандартной технике ТИАБ, а также по имеющимся данным имплантации опухолевых клеток при проведении биопсии солидных опухолей в общей онкологии [165] нами было предложено использовать витреоретинальные порты в качестве проводника для биопсийной иглы, позволяющего исключить контакт иглы как потенциального «переносчика» клеток опухоли со стенками пункционного канала - со склерой. Выполнению ТИАБ через pars plana предшествовало установление в 3,5-4 мм от лимба витреоретинального порта, соответствующего размеру пункционной иглы.
Склеротомию осуществляли по принципу двухпрофильного прокола для максимального «схлопывания» склерального канала по извлечению витреоретинального порта. Установку порта проводили с учетом локализации опухоли, избегая мест проекции основания опухоли на склеру. В настоящее время в мировой литературе не описано способов борьбы с интраоперационным кровотечением, возникающим при ТИАБ внутриглазных опухолей в 2-46 % случаев [62, 190]. Для решения этой задачи в случаях опухолей малого размера и опухолей с богатой сосудистой сетью было предложено устанавливать дополнительный витреоретинальный порт диаметром от 25G до 27G для подачи через него жидкости – сбалансированного раствора BSS (Патент РФ №2698448). Под контролем операционного микроскопа биопсийную иглу направляли к максимально удаленной от макулы проминирующей поверхности опухоли вне отслойки сетчатки. В ряде случаев для моделирования биопсии и отработки техники ТИАБ опухолей малой проминенции иглу направлял к склону опухоли или, при возможности, к зоне плоскостного роста УМ.
При вколе иглы в толщу опухоли ощущали небольшое сопротивление поверхности опухоли с последующим «провалом» иглы в толщу очага. При большой высоте УМ (свыше 8мм) иглу вводили на глубину 3-5мм. В случае ТИАБ очагов проминенцией 2-4мм введение иглы осуществляли до упора иглы в склеру без дальнейшего продвижения во избежание перфорации фиброзной капсулы глаза.
При погружении острия иглы в опухоль начинали аспирацию ткани очага путем создания отрицательного давления при помощи шприца. Одновременно с аспирацией осуществляли легкое вращение иглы вокруг оси, что позволяло «отсепаровывать» столбик опухоли в полости иглы от окружающих тканей. Также проводили одномоментное нагнетание жидкости в полость глаза до создания офтальмогипертензии, контролируемой пальпаторно. До извлечения иглы из толщи опухоли мягкую трубку-проводник пережимали зажимом. По мере извлечения иглы нагнетание жидкости прекращали. Создание кратковременной гипертензии способствует компрессии поврежденных сосудов и сокращает выраженность кровотечения при проведении ТИАБ in vivo.
Кроме того, повышение внутриглазного давления создает условия для большего продвижения опухолевых масс в свободное пространство (просвет иглы), сокращая время, затрачиваемое на манипуляцию, и повышая информативность ТИАБ.
Рисунок 3.3 - Вид (А) и схема иглы (В) с косорезанным рабочим концом, имеющим продолжение на противоположной острию иглы части трубки в виде прорези
Таблица 3.1. Параметры инъекционных и разработанных игл
Транссклеральную ТИАБ выполняли на 71 глазу при использовании тонкостенных коротких игл 25G и 27G. Перед забором ткани границы опухоли маркировали хирургическим маркером при проведении трансиллюминации. Кроме того, оценивали локализацию наиболее проминирующей части опухоли на предоперационном этапе для выбора места пункции. Далее офтальмологическим лезвием формировали интрасклеральный тоннель в форме треугольника на ⅔ глубины склеры длиной 2-3мм, через который производили вкол иглы в ткань опухоли под острым углом с последующей аспирацией опухолевой ткани. Точку вкола иглы выбирали эксцентрично по отношению к проекции максимальной проминенции очага, направляя иглу к этой части. До извлечения иглы из толщи опухоли на мягкую трубку-проводник также накладывали зажим для избегания возможной аспирации воздуха при переходе конца иглы в воздушное пространство и забрасывания клеток в вышележащие отделы трубки и шприц. Пустой шприц 3-5мг отсоединяли от мягкой трубки-проводника, затем -зажим, и присоединяли к трубке шприц с заранее забранным консервантом «ЦитоПротект» (ООО «Евроген Лаб», Москва) в объеме 4 мл. Производили трехкратное промывание биопсийной системы консервантом, предварительно опустив конец иглы в пробирку типа Eppendorf 4мл. Клеточность материала ТИАБ на интраоперационном этапе оценивали под микроскопом на большом увеличении.
При сомнении в достаточности полученного аспирата возможно выполнять повторную пункцию опухоли, что, однако, не проводили ни в одном случае на энуклеированных глазах. Манипуляцию завершали извлечением порта (в случае проведения трансвитреальной ТИАБ) и наложением узлового эписклерального шва 8-0 на склеральный канал.
Забранный материал ТИАБ отправляли на последующий цитологический и генетический анализ в лабораторию ООО «Евроген Лаб», Москва.
Удаленный глаз помещали в 10% раствор нейтрального формалина и передавали для морфологического исследования опухоли.
3.1.2. Техника обработки материала ТИАБ
Материал ТИАБ забирали в пробирки с консервантом «ЦитоПротекст Е» (ООО «Евроген Лаб», Москва, Россия) и передавали в лабораторию (ООО «Евроген Лаб», Москва, Россия) для осуществления первичной обработки с последующим цитологическим и молекулярно-генетическим тестированием.
Первичную обработку материала ТИАБ осуществляли методом жидкостной цитологии. Использовали материалы и реагенты серии «ЦитоСкрин» (ООО «Хоспитекс Диагностикс», Москва). Обработку проводили по технике центрифугирования-отстаивания: материал ТИАБ центрифугировали с ускорением 1000 rcf в течение 20 минут, после чего сформировавшийся осадок ресуспедировали в минимальном количестве супернатанта, добавляли эквивалентный объем фиксирующей жидкости, вносили в цитокамеру с предварительно вставленным предметным стеклом, отстаивали раствор в цитокамере в течение 20 минут и переносили его в другую цитокамеру с предварительно вставленным предметным стеклом. Использовали только предметные стекла с адгезивным покрытием из поли-L-лизина (ООО «АпексЛаб», Москва, Россия). С каждого образца изготавливали по 4 стеклопрепарата.
Изготовленные стеклопрепараты окрашивали азуром и эозином по стандартной методике, подвергали цитологическому исследованю методом световой микроскопии, при необходимости осуществляли фотофиксацию полученной цитологической картины и далее использовали окрашенные стеклопрепараты для проведения молекулярных тестов in situ (методами FISH и ИЦХ). Для анализа окрашенных стеклопрепаратов использовали микроскоп BioRevolution BZ-9000 (Keyence Corporation, Осака, Япония). Фотофиксацию осуществляли на том же микроскопе с использованием объектива с увеличением 60X и иммерсионного масла типа F (Leica Microsystems, Вецлар, Германия).
Супернатант, остававшийся после первичной обработки материала ТИАБ, использовали для выделения ДНК и проведения молекулярных тестов in vitro (методами Супер-АС-ПЦР-РВ и ПЦР с последующим секвенированием продуктов ПЦР). Выделение ДНК осуществляли с использованием наборов реагентов серии «QiaAmp» (Qiagen, Хильден, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Контроль концентрации и качества выделенной ДНК осуществляли методом ПЦР-РВ с помощью набора «aXY-Детект» (ООО НПФ «Синтол», Москва, Россия) в соответствии с инструкцией производителя. В качестве контролей использовали три стандартных образца ДНК, изготовленных из фрагментированной геномной ДНК из клеточной линии человека Raji (ЗАО «Евроген», Москва, Россия, кат. № NA102), доведенной с помощью воды бидистиллированной деионизованной (MilliQ – ЗАО «Евроген», Москва, Россия) до финальной концентрации 25, 3,5 и 0,5 нг/мкл. Набор «aXY-Детект» позволяет получить данные о количестве ДНК (канал FAM), определить пол пациента (каналы ROX и VIC), выявить присутствие ингибитора (канал Cy5).
Пригодными для дальнейшей работы признавали образцы, соответствующие следующим четырем критериям:
1) Кривые амплификации по всем 4-м каналам имеют стандартную сигмообразную форму;
2) Рассчитанная концентрация ДНК (по каналу FAM) не ниже 0,01 нг/мкл;
3) XY-статус исследуемого образца (определяемый по наличию амплификации в каналах VIC и ROX) соответствует биологическому полу донора соответствующего биоматериала;
4) Значение CT по каналу Cy5 не превышает 42 [бОльшие значения допускаются при условии, если рассчитанная концентрация ДНК (по каналу FAM) превышает 20 нг/мкл].
Таким образом, для целостной технологии ТИАБ разработаны варианты хирургической техники, включающей как транссклеральный, трансвитреальный, так и транскорнеальный доступы, предложены собственный оптимальный инструментарий манипуляции и способы профилактики и купирования интра- и послеоперационных осложнений.
Кроме того, метод жидкостной биопсии предложено использовать для сохранения и последующего исследования биопсийного материала
