• По каким принципам следует отбирать донорский материал для выделения клеток РПЭ?
• Как следует выделять клеточный материал технически?
• Насколько суспензия выделенных клеток РПЭ является чистой, т.е. лишенной примесных клеток и волокон сетчатки и стекловидного тела?
• Удается ли при применении разработанной техники сохранить целостность сетчатки и стекловидного тела?
• Какова степень жизнеспособности клеток РПЭ, выделенных по разработанной методике?
Ответы на эти вопросы содержатся в соответствующих подглавах раздела 3.1.
3.1.1. Принципы первичного отбора глазных яблок для выделения ретинального пигментного эпителия
К настоящему времени уверенно продемонстрирована корреляция между функциональной активностью клеток РПЭ и возрастом. Клетки РПЭ подвержены значительным приобретенным и запрограммированным возрастным эпигенетическим изменениям, что, по мнению ряда авторов является причиной развития ВМД в возрастной категории старше 50 лет. Таким образом, для конструирования трансплантатов с наибольшим потенциалом приживления первично отбирали материал от доноров моложе 50 лет.
Данные о возрасте доноров, времени их смерти и времени энуклеации предоставлялись специалистами Бюро судебно-медицинской экспертизы в сопроводительной документации.
Гладкие миоциты радужной оболочки и клетки РПЭ, будучи одного эмбрионального происхождения, обладают единой динамикой изменения энергетического потенциала в постмортальном периоде [3], что обусловило принцип отбора ГЯДТ по наилучшим показателям адреналиновой пробы по С.А. Борзенку – показателям А и В.
Отбор ГЯДТ по интервалу времени между наступлением смерти и энуклеацией основывали на анализе имеющихся литературных данных по культивированию РПЭ. Встречаются упоминания как об использовании материала, забранного после энуклеации как от живого донора [274], так и о культивировании РПЭ, выделенного из ГЯДТ, энуклеированных в различные сроки после смерти – от 2 до 25 часов c наилучшими результатами при использовании донорского материала с постмортальным временем не более 12 часов от момента смерти до гипотермии с пребыванием в гипотермии не более 48 часов [273, 87, 178, 257, 43].
Особенность разработанной методики выделения такова, что для успешного препарирования требуется поддержание давления в стекловидном теле, что обусловливает необходимость отбора глазных яблок по признаку сохранения целостности витреальной полости.
Оригинальная методика выделения РПЭ (опыт)
Для выделения клеток РПЭ по разработанной методике отбирались ГЯДТ:
1. Доноры которых успешно прошли этап проверки на инфекционную безопасность.
2. Доноров моложе 50 лет.
3. Имеющие показатели адреналиновой пробы по С.А. Борзенку А и В.
4. Энуклеированные и помещенные в условия гипотермии не позднее 12 часов post mortem и пребывавшие в гипотермии не более 48 часов.
5. При внешнем осмотре которых после выкраивания роговично-склеральных дисков не обнаруживали признаков ятрогенного повреждения передней гиалоидной мембраны, пролапса стекловидного тела, отслоения сетчатки и/или сосудистой оболочки - глазное яблоко сохраняет округлую форму, будучи размещенным на плоской твердой поверхности, не уплощается, не имеет склеральных вмятин, стекловидное тело полностью находится в витреальной полости. Допускались посттрепанационные разрезы цилиарного тела и разрывы корня радужной оболочки без признаков пролапса стекловидного тела сквозь них.
Таблица 12 Чистота выделяемой суспензии РПЭ в опытной и контрольной группах А
Таблица 13 Чистота выделяемой суспензии РПЭ в опытной и контрольной группах В
Для выделения клеток РПЭ в контрольной группе отбирались ГЯДТ:
1. Доноры которых успешно прошли этап проверки на инфекционную безопасность.
2. Доноров моложе 50 лет.
3 Имеющие показатели адреналиновой пробы по С.А. Борзенку А и В.
4. Энуклеированные и помещенные в условия гипотермии не позднее 12 часов post mortem и пребывавшие в условиях гипотермии не более 48 часов. Условие целостности витреальной полости не было принципиальным при применении известной методики выделения.
3.1.2. Разработка оригинальной методики выделения клеток ретинального пигментного эпителия
Глазное яблоко, соответствующее критериям, описанным в разделе 3.1.1., полностью погружали в стерильную чашку Петри (10 см), наполненную DMEM/F12, нагретым в инкубаторе до 37° С, в качестве иммерсионной среды, что позволяло минимизировать деформирующее действие гравитации и высыхания на ткани глаза.
Склеру рассекали спереди назад двумя, тремя, или четырьмя меридиональными разрезами длиной ⅔ длины глазного яблока, параллельными переднезадней оси глаза через равные промежутки с получением двух, трех или четырех «лепестков» склеры (рис. 1.А). «Лепестки» склеры поочередно отгибали, и со стороны супрахориоидального пространства пересекали вортикозные вены и внутрисклеральную часть зрительного нерва, после чего склеру удаляли из операционного поля (рис. 1.В). Далее наносили три разреза ХПК – первый круговой разрез – на расстоянии 1 мм от зубчатой линии (рис. 1.C), один меридиональный разрез – в любом меридиане в направлении от первого разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез – на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва; далее ХПК аккуратно отделяли от нейральной сетчатки пинцетом и укладывали на дно стерильной чашки Петри в положении «клетками РПЭ вверх» (рис. 1.D.), заливали двумя мл смеси раствора 0,25% трипсина -ЭДТА и раствора Версена в соотношении 1:1 по объему, инкубировали в стандартных условиях (37°С, 5% CO2 ) в течение 20 минут. По окончании инкубации в чашку Петри для нейтрализации ферментативной смеси добавляли 1 мл эмбриональной телячей сыворотки (FBS) и отделяли клетки РПЭ от мембраны Бруха гидродинамически многократным промыванием струей стерильного фосфатно-солевого буфера под напором из шприца. Полученную суспензию клеток РПЭ переносили в центрифужную пробирку 15 мл (заявка на патент РФ № 2014152572).
Таблица 14 Схема бальной оценки степени целостности ИХЦВРК
Таблица 15 Результаты оценки целостности ИХЦВРК в опытной группе
Пробу суспензии РПЭ объемом 100 мкл переносили в чашку Петри (35 мм) и исследовали с помощью инвертированного микроскопа при увеличении х100 – качественно оценивали степень чистоты суспензии в баллах, наличие в поле зрения сторонних элементов помимо клеток РПЭ – фрагментов сетчатки, волокон стекловидного тела, меланоцитов хороидеи. В таб. 11 представлена система бальной оценки.
При наличии в поле зрения клеток РПЭ и эритроцитов без посторонних элементов образцу выставлялся балл «0». Таким образом, бальная оценка составляла от «0» до «3» включительно.
В таб. 12 и 13 представлены результаты оценки чистоты суспензии клеток РПЭ в опытной и контрольной группах при результатах адреналиновой пробы А и В, соответственно. Образцам присваивался номер соответственно номеру донора (см. раздел 2.1.1). Была выявлена статистически достоверная разница в чистоте суспензии клеток РПЭ, выделяемой по известной и разработанной методикам (p<0,01) вне зависимости от результатов адреналиновой пробы (p>0,05 как в группе А, так и в группе В).
3.1.4. Оценка целостности иридо-хрусталиково-цилио-витрео-ретинального комплекса
При препарировании глазного яблока по предложенной методике разрезы наносились на склеральную оболочку, внутрисклеральную часть зрительного нерва, вортикозные вены и хороидально-пигментный комплекс. Остальные составляющие глазного яблока (иридо-хрусталиково-цилио-витрео-ретинальный комплекс, ИХЦВРК) в большинстве случаев оставались нетронутыми, (рис. 2), сетчатка не повреждалась, витреальная полость оставалась невскрытой, так что попадание в культуру клеток РПЭ фрагментов сетчатки и волокон стекловидного тела было минимально.
Для оценки целостности ИХЦВРК была разработана схема бальной оценки степени повреждения (таб. 14). Целостность комплекса оценивали макроскопически под прямым бинокулярным световым микроскопом при увеличении х4, присваивая баллы в зависимости от наличия признаков повреждения.
В контрольной группе после препарирования единым оказывался иридо-цилио-хрусталиковый комплекс, витреальная полость во всех случаях была вскрыта, стекловидное тело было дезинтегрировано, сетчатая оболочка – обрезана вокруг диска зрительного нерва. Внутри «глазной чаши» на внутренней поверхности пигментного слоя сетчатки макроскопически и тактильно обнаруживались остатки стекловидного тела, удалить которые не представлялось возможным.
3.1.5. Оценка жизнеспособности выделенного клеточного материала
В таб. 16 представлены результаты оценки жизнеспособности клеток РПЭ, выделенных по разработанной нами и известной методикам.
При анализе статистической значимости различий между жизнеспособностью выделенного клеточного материала статистически достоверной разницы не выявлено ни при сравнении жизнеспособности клеточного материала опытных и контрольных групп донорских глаз одного показателя адреналиновой пробы, ни при сравнении жизнеспособности клеточного материала в обеих опытных и обеих контрольных группах с различными показателями адреналиновой пробы:
• Сравнение опыт-контроль (проба А) – F=0,62, p>0,05;
• Сравнение опыт-контроль (проба В) – F =0,08, p>0,05;
• Сравнение опытных групп (проба А и В) – F=0,69, p>0,05;
• Сравнение контрольных групп (проба А и В) – F=0,05, p>0,05.
Таким образом, не было выявлено статистически достоверной разницы ни жизнеспособности клеток РПЭ, выделяемых по разным методикам, ни жизнеспособности клеток, выделяемых от доноров с показателями адреналиновой пробы А и В.
Таким образом, в ходе первого этапа работы была разработана методика выделения клеток РПЭ из глаза трупа-донора для трансплантации. Были обоснованы принципы первичного отбора донорского материала – отбирались глаза доноров, умерших в возрасте до 50 лет, с показателями адреналиновой пробы по Борзенку С.А. А и В, энуклеированные не позднее чем через 12 часов после смерти донора и обладающие определенным уровнем механической сохранности оболочек.
Была разработана техника выделения клеток РПЭ «наружным доступом» без нарушения целостности сетчатки и стекловидного тела донорского глаза. Был показан статистически достоверно более высокий уровень чистоты суспензии клеток РПЭ, получаемой по разработанной методике, по сравнению с суспензией, получаемой по известной методике.
Было показано, что уровни жизнеспособности клеток, выделяемых по разработанной и известной методикам, статистически достоверно не различаются.
