Рисунок 11 – Первично выделенная культура РПЭ, фазово-контрастная микроскопия а – ув. х 50; б – ув. х 100
Рисунок 12 – Первичная 2D культура РПЭ, 3-и сутки культивирования, фазово-контрастная микроскопия, ув. х 100 а – опытная группа; б – контрольная группа
При проведении световой микроскопии первично выделенных клеток РПЭ оценивали чистоту полученных суспензий. Во всех образцах попадание в культуру клеток РПЭ фрагментов сетчатки и волокон стекловидного тела также было минимально. Это свидетельствует о том, что частично модифицированная ранее разработанная методика выделения РПЭ на трупных глазах человека применима к кроличьим глазам.
Полученные культуры клеток 1-й опытной (повышенное содержание в питательной среде ростовых факторов) и 2-й контрольной (стандартный состав питательной среды) групп в условиях 2D культивирования формировали монослой и имели характерную гексагональную форму с большим количеством пигмента. Уже на 1-е сутки в обеих группах отмечали адгезию большинства клеток РПЭ к дну культурального матраса.
Рисунок 13 – Первично выделенная культура РПЭ в пробирке с питательной средой после центрифугирования. Осадок клеток РПЭ отмечен стрелкой
Рисунок 14 – 2D культура РПЭ Р1, фазово-контрастная микроскопия, ув. х 100 а – опытная группа; б – контрольная группа
На 5 – 7-й день в каждом из 10 образцов 1-й опытной группы был получен монослой клеток с 80% конфлуэнтностью. Далее все клетки 1-й опытной и 2-й контрольной групп ферментативно дезагрегировали для проведения сравнительного количественного анализа. Было выявлено, что в 1-й опытной группе количество клеток РПЭ достоверно значительно превышает количество клеток во 2-й контрольной группе. Таким образом, было установлено, что удвоенное количество ростовых факторов в питательной среде достоверно способствует увеличению количества клеток РПЭ за значительно более короткий промежуток времени. В таблице 9 представлено количество клеток РПЭ, полученных в 1-й опытной и 2-й контрольной группах спустя 1 неделю после выделения и начала культивирования. Количество клеток РПЭ было статистически значимо больше в 1-й опытной группе (р<0,05).
После ферментативной дезагрегации и подсчета клеток каждый образец 1-й опытной группы пересеивали на три культуральных матраса, таким образом получали культуру РПЭ 1-го пассажа – Р1.
Клетки 2-й опытной группы продолжали культивировать. 80%-я конфлуэнтность была достигнута в течение 3-4 недель. Далее каждый образец также пересеивали на три культуральных матраса для получения Р1.
Клетки РПЭ P1 также имели полигональную форму, отмечали уменьшение количества пигмента.
После получения достаточного количества клеток РПЭ Р1 в обеих группах проводили иммуноцитохимическое исследование для фенотипической идентификации полученных культур.
