3.1. Сравнительный анализ эффективности различных протоколов децеллюляризации лентикулярного материала

     Сравнительный анализ эффективности различных протоколов децеллюляризации ЛМ был проведен в следующих направлениях:

    - Прозрачность нативного ЛМ в транспортировочных средах в процессе его переноса из операционного блока до лаборатории ГТБ методом спектрофотометрии.

    - Прозрачность децеллюляризированного и нативного ЛМ с помощью спектрофотометрического метода исследования.

     - Наличие либо отсутствие клеточных компонентов, а также сохранность общей коллагеновой структуры матрикса с помощью гистологического окрашивания децеллюляризированного и нативного ЛМ.

    - Экспрессия коллагена I, III, V и VI типов, а также наличие или отсутствие ядерных компонентов с помощью флюоресцентного окрашивания децеллюляризированного и нативного ЛМ.

    - Ультраструктура коллагенового матрикса децеллюляризированного и нативного ЛМ с помощью сканирующей электронной микроскопии.

    - Остаточное содержание ДНК в децеллюляризированном и нативном ЛМ с помощью флуориметрического метода.

    3.1.1 Результаты исследования прозрачности лентикулярного материала в разных транспортировочных средах

     Исследование лучшей среды для транспортировки ЛМ в рамках прозрачности проводили с помощью спектрофотометрического метода. Графический и внешний вид полученных данных представлен на рисунке 14 и 15.

    Результаты сравнения экспериментальных групп между собой подвергли статистическому анализу (Таблица 12).

    С учетом полученных данных можно утверждать об отсутствии статистически значимой разницы при сравнении группы 1 с группой 2 (82,54±2,57% против 84,85±2,47%; (82,56 (80,84-84,1)) против (85,43 (83,65-86,21)) и группы 3 с группой 4 (87,64±2,28% против 89,35±2,38%; (87,89 (86,65-88,9)) против (89,6 (88,22-90,5)) (Рисунок 16). Статистически значимое различие определялось при сравнении группы 1 с группами 3 и 4 (р≤0,05), а также группы 2 с группами 3 и 4 (р≤0,05). По изменению прозрачных свойств ЛМ, исследуемые группы располагаются в порядке снижения признака следующим образом: группа 4, группа 3, группа 2, группа 1.

    Обобщая результаты проведенного спектрофотометрического анализа прозрачности ЛМ нами была выбрана группа 4 в качестве среды для транспортировки ЛМ.

     3.1.2. Результаты спектрофотометрии прозрачности ЛМ после децеллюляризации

    В данной части работы проводили сравнение разных протоколов децеллюляризации ЛМ в рамках прозрачности. Графический и внешний вид полученных данных представлены на рисунке 17 и 18.

    Различия полученных данных в исследуемых группах подвергли статистической обработке (Таблица 13).

    С учетом полученных данных можно утверждать об отсутствии статистически значимой разницы при сравнении группы 1 с группой 2 (89,50±4,72% против 88,89±3,57%; (90,45 (85,88-93,34)) против (88,95 (86,34-91,55)); группы 1 с группой 3 (89,50±4,72% против 87,26±3,15%; (90,45 (85,88-93,34)) против (87,25 (85,24-88,83)); группы 2 с группой 3 (88,89±3,57% против 87,26±3,15%; (88,95 (86,34-91,55)) против (87,25 (85,24-88,83)). Статистически значимая разница определялась при сравнении группы 4 (47,64±12,88% (47,24 (43,64-55,94)) с каждой из остальных групп, р≤0,05 (Рисунок 19).

     Проведенное спектрофотометрическое исследование прозрачности ЛМ после децеллюляризации показало, что в группе 4 прозрачность была значительно снижена по сравнению с группой 1, а наиболее приближенными к контролю были результаты в группах 2 и 3 (Рисунок 17). Однако спектрофотометрически прозрачность протокола в группе 2 на ближнем и средневолновом участках спектра выше, чем у протокола в группе 3.

    3.1.3. Результаты гистологического анализа

    При гистологическом окрашивании гематоксилином и эозином, по методу Ван-Гизон и альциановым синим выявлено полное удаление клеточных компонентов и отсутствие значимого повреждения структуры ВКМ в полученном ацеллюлярном матриксе в группах 2 и 3. Группа 4 на фоне полного отсутствия клеток и клеточных ядер характеризуется значительным повреждением структуры матрикса (Рисунок 20).

    3.1.4. Результаты иммуногистохимического анализа

    Флюоресцентное окрашивание ядер красителем Hoechst показало, что ЛМ, подвергшиеся децеллюляризации в группах 2, 3, 4 окрашиваются негативно. При этом, в группе 1 определяется характерное свечение ядер. Кроме того, по данным ИГХ в контрольной и экспериментальных группах отмечалась положительная экспрессия коллагена I, III, V и VI типов (Рисунок 21). В группе 4 отмечалось разрушение структуры коллагена I, III, V и VI типов.

    3.1.5. Результаты сканирующей электронной микроскопии

     При анализе толщины фибрилл коллагеновых волокон образцов были выявлены различия, как между контрольной и опытными группами, так и при попарном сравнении опытных групп между собой, р≤0,05 (Рисунок 22).

    Статистически значимые различия наблюдались при сравнении группы 2 с группой 1 (1,96±0,46 мкм против 2,30±0,40 мкм; (1,9 (1,69-2,21)) против (2,26 (2,03-2,63)), группы 3 с группой 1 (1,36±0,25 мкм против 2,30±0,40 мкм; (1,36 (1,21-1,47)) против (2,26 (2,03-2,63)), группы 4 с группой 1 (4,19±0,56 мкм против 2,30±0,4 мкм 0; (4,13 (3,85-4,54)) против (2,26 (2,03-2,63)). Попарное сравнение опытных групп между собой выявило статистически значимые различия, р≤0,05 (Рисунок 22).

    Различия полученных данных ИГХ в исследуемых группах подвергли статистической обработке (Таблица 14).

     На рисунке 23 видно, что группа 3 из-за отсутствия достаточного обьема коллагеновых волокон, в основном представлена разволокненными фибриллами. В группе 4 отмечалось заметное утолщение фибрилл коллагеновых волокон, вызванное грубым нарушением их ультраструктуры. В группе 2 выявлено незначительное изменение состояния фибрилл коллагеновых волокон.

    3.1.6. Результаты анализа содержания ДНК

    Результаты ДНК-анализа нативного и ДЛМ выявили статистические различия, как между экспериментальными группами и контролем, так и экспериментальными группами между собой, р≤0,05: группа 2 с группой 1 (39,34±8,65 нг/мг против 132,18±44,17 нг/мг; (41,99 (38,57-44,67)) против (128,5 (102,02-154,48)), группа 3 с группой 1 (37,07±6,19 нг/мг против 132,18±44,17 нг/мг; (39,74 (36,72-42,75)) против (128,5 (102,02-154,48)), группа 4 с группой 1 (13,42±7,4 нг/мг против 132,18±44,17 нг/мг; (11,45 (8,47-16,86)) против (128,5 (102,02-154,48)). При сравнении опытных групп между собой статистически значимые различия были выявлены во всех случаях (Таблица 15).

     Во всех протоколах после обработки образцов содержание остаточного ДНК было меньше 50 (нг/мг), что соответствовало критериям эффективности децеллюляризации органов и тканей, предложенных Crapo с соавторами [54]. Содержание остаточнвх фрагментов ДНК было наименьшим в группе 4 Трипсин-ЭДТА (Рисунок 24).

    Таким образом, в результате проведенного спектрофотометрического исследования прозрачности материала была доказано, что транспортировка образцов в ДВ позволяет сохранять высокую прозрачность образцов и упрощает процедуру измерения прозрачных свойств роговичной ткани. Использование ДВ в качестве среды для транспортировки материала оправдано, с одной стороны, в связи с постоянным его наличием в операционных блоках и широкому применению в офтальмохирургической практике. С другой стороны, благодаря дегидратационным свойствам, ДВ является альтернативой раствору глицерина, который также используется для устранения неспецифического отека ЛМ перед спектрофотометрическим измерением его прозрачности, в случае если образцы были доставлены из операционной в лабораторию в растворах PBS или иных средах для хранения роговицы, способных вызвать отек роговичной ткани и снижающие ее прозрачность. В результате сравнения различных протоколов децеллюляризации на основе детергентов, наибольшую эффективность показали растворы 1,5M NaCl с нуклеазами и 0.1% SDS. По результатам физического, генетического и иммуногистохимического анализов данные протоколы позволили практически полностью удаляют клеточные компоненты и фрагменты ДНК из ткани. При этом структура ВКМ не была значимо изменена, что и определило высокую прозрачность ткани.