Рисунок 8 – Фрагмент удаленной эпиретинальной мембраны из первой группы. Иммунофлуоресцентное окрашивание, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, ядра ДНК (Hoechst, синее свечение). Увеличение X 100 А – глиальные клетки, положительная экспрессия к GFAP (зеленое свечение) Б – единичные миофибробластоподобные клетки экспрессирующие α-SM актин (зеленое свечение) и виментин (красное свечение); В – единичные клетки, экспрессирующие Snail + Slug (зеленое свечение); Г – слабая экспрессия коллагена VI (зеленое свечение) и коллагена IV (красное свечение)
Рисунок 9 – Фрагмент удаленной эпиретинальной мембраны из первой группы. Иммунофлуоресцентное окрашивание, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, ядра ДНК (Hoechst, синее свечение). Увеличение X 600 А – клетки, экспрессирующие одновременно белки GFAP (красное свечение) и α-SM актин (зеленое свечение); Б – единичные миофибробластоподобные клетки, экспрессирующие α-SM актин (зеленое свечение) и виментин (красное свечение);
3.2.1. Характеристика образцов удаленных идиопатических эпиретинальных мембран у пациентов с МКОЗ 0,9 - 0,7 (1 - ая группа)
В 25 образцов удаленных идиопатических эпиретинальных мембран отмечено появление экспрессии маркеров и индуктора ЭМТ: виментина, α-SM актина, Snail + Slug, компонентов ЭЦМ (коллаген IV и VI типов).
В подобных мембранах во всех образцах превалировало большое количество клеток глиального происхождения (клетки Мюллера и астроциты).
Иммуногистохимическим маркером глиальных клеток сетчатки является глиальнокислый фибриллярный протеин (GFAP), клеточный ретинальдегид связывающий протеин (CRALBP), который представляет собой целлюлярный филаментобразующий белок, особенно представленный в клетках Мюллера [56] (Рисунок 8 А). В 7 случаях (28%) выявлены гиалоциты, маркер – CD 45, в 4-х случаях (16%) – клетки, экспрессирующие одновременно GFAP и α-SM актин (Рисунок 9 А). Преобладание астроцитов, клеток Мюллера в образцах данной группе подтверждало начальную стадию пролиферативного процесса. Находясь на поверхности витреоретинального интерфейса данные клетки со временем «активируются» – подвергаются морфологическим изменениям и трансдифференцировке и начинают проявлять сократительную активность.
В данных образцах мембран были выявлены единичные клетки, экспрессирующие виментин в 10 случаях (40 %), который является маркером начальной стадии ЭМТ (Рисунок 8 Б, 9 Б). Его появление указывало на перестройку цитоскелета клетки. Также в 14 случаях (56 %) был выявлен α-SMА – маркер дифференцировки гладкой мускулатуры и активированных фибробластов (Рисунок 8 Б, 9 Б). Его наличие подтверждало переход глиальных клеток и гиалоцитов в мезенхимальный фенотип, показывая начало пролиферативного процесса. Учитывая данные литературных источников основным пусковым механизмом, активирующим трансдифференцировку клеток Мюллера в миофибробластоподобные клетки, является выделение фактора роста TGF-β1 [21, 23, 117]. Миофибробластоподобные же клетки играют одну из ключевых ролей в формировании ЭРМ. Они выделяют компоненты внеклеточного матрикса – фибронектин и коллаген, а также белок α-SM актин, который обладает сократительной активностью и способствует усилению контракции ткани.
Кроме этого, во всех мембранах был выявлен маркер Snail + Slug, специфическое окрашивание которым свидетельствует об активации программы ЭМТ (Рисунок 8 В).
В 7 образцах (28%) выявлено незначительное количество коллагенов IV и VI типов (Рисунок 8 Г). Известно, что IV тип коллагена – является ключевым структурным компонентом ВПМ. Он формирует супрамолекулярную сеть базальной мембраны, оказывающую влияние на адгезию, миграцию и дифференцировку различных клеток. VI тип относят к классу «молодых» коллагенов, образующих микрофибриллы. Он играет важную роль в прикреплении клеток к фибриллам, а также обеспечивает клеточную адгезию путем присоединения к мембранным адгезивным белкам. Кроме того, данный тип коллагена может связываться с фибриллами интерстициальных коллагенов, протеогликанами и гликозаминогликанами, обеспечивая прочную связь между клетками и внеклеточным матриксом.
3.2.2. Характеристика образцов удаленных идиопатических эпиретинальных мембран у пациентов с МКОЗ 0,6 - 0,3 (2 - ая группа)
Рисунок 10 – Фрагмент удаленной эпиретинальной мембраны из второй группы. Иммунофлуоресцентное окрашивание, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, ядра ДНК (Hoechst, синее свечение). Увеличение X 100 А – глиальные клетки, положительная экспрессия к GFAP (зеленое свечение); Б – увеличение количества миофибробластоподобных клеток, экспрессирующих α-SM актин (зеленое свечение) и виментин (красное свечение); В – миофибробластоподобные клетки, экспрессирующие α-SM актин (зеленое свечение); Г – умеренное количество клеток, экспрессирующие Snail + Slug (зеленое свечение); Д – выраженная экспрессия коллагенов IV (красное свечение) и коллагена VI (зеленое свечение) типов; Е – GFAP и CRALBP (выделен красным). Глиальные клетки отличаются яркой красной флюоресценцией, спиралевидной формой, что указывает на контрактильный фенотип.
Рисунок 11 – Фрагмент удаленной эпиретинальной мембраны из третьей группы. Иммунофлуоресцентное окрашивание, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, ядра ДНК (Hoechst, синее свечение). Увеличение X 100 А – единичные глиальные клетки, положительная экспрессия к GFAP (зеленое свечение); Б – выраженное количество миофибробластоподобных клеток, экспрессирующих α-SM актин (зеленое свечение) и виментин (красное свечение); В – выраженное количество клеток, экспрессирующие Snail + Slug (зеленое свечение); Г – превалирующая экспрессия коллагенов IV (красное свечение) и коллагена VI (зеленое свечение) типов;
В данных образцах выявлено снижение клеток, экспрессирующих GFAP (Рисунок 10 А), CD 45 и СRALBP, и одновременное увеличение клеток, экспрессирующих α-SMА, что говорило о прогрессировании процесса трансформации данных клеток в миофибробластоподобные. Приобретая свойства миофибробластов, снижается специфическое окрашивание исходных клеток. При этом отмечалось спиралевидное изменение их формы (глиальных клеток), что, в свою очередь, свидетельствовало о контрактильных процессах в ЭРМ (Рисунок 10 Е).
В образцах отмечено увеличение клеток, экспрессирующих виментин, α-SMА, Snail + Slug. Во всех мембранах 25 случаях (100 %) были выявлены подобные маркеры (Рисунок 10 А, Б, В). Увеличение в зонах фиброза гладкомышечного актина свидетельствовало о повышении пула мезенхимальных клеток. Увеличение количества активных пролиферирующих клеток свидетельствовало о прогрессировании патологического процесса.
Коллагены IV и VI типов был выявлен в 22 случаях (88%); увеличение в мембранах коллагенов также свидетельствовало об увеличении пула трансдифференциированных клеток в ЭРМ (Рисунок 10 Г).
3.2.3. Характеристика образцов удаленных идиопатических эпиретинальных мембран у пациентов с МКОЗ 0,25 - 0,05 (3 - ая группа)
В 25 образцах удаленных идиопатических эпиретинальных мембран выявлена гиперпродукция компонентов ЭЦМ (коллагены IV и VI типов) и еще более выраженное увеличение экспрессии маркеров и индуктора ЭМТ: виментина, α-SM актина, Snail + Slug, по сравнению с предыдущими группами, а также выраженное снижение количества глиальных клеток сетчатки и гиалоцитов.
Клетки, экспрессирующие GFAP и CRALBP, были обнаружены в 7 образцах (28 %) (Рисунок 11 А); в 5 образцах (20%) выявлены гиалоциты, маркером которых является CD 45 (Рисунок 12 А). Выраженное снижение данных маркеров свидетельствовало о снижении количества данных типов клеток в мембранах, что говорило о практически завершенном процессе трансформации клеточного состава.
Однако данные мембраны характеризовались прогрессирующим увеличением количества клеток, экспрессирующих α-SMА, Snail + Slug и виментина. Во всех мембранах 25 случаях (100 %) были выявлены подо бные маркеры (Рисунок 11 Б, В). Также во всех 25 случаях (100%) выявлены коллагены IV и VI типов (Рисунок 11 Г, 12 Б). Превалирование в образцах мембран коллагенов обусловлено, в свою очередь, увеличением количества миофибробластоподобных клеток, ответственных за продукцию компонентов ЭЦМ. Выявленные изменения мембран свидетельствовали о завершении процессов пролиферации и трансформации клеток.
Согласно результатам проведенного исследования, эпиретинальные мембраны представляют собой многослойные образования, включающие один или несколько слоев различных типов клеток, произвольно ориентированные волокна экстрацеллюлярного матрикса, фрагменты ВПМ.
Процесс фиброгенеза на поверхности сетчатки зависит от ремоделирования коллагена в результате реорганизации внеклеточного матрикса [17]. В норме существует баланс между синтезом и распадом коллагена. Однако нарастание пула трансдифференциированных клеток в ЭРМ приводит к выраженному дисбалансу: продукция коллагена начинает превалировать над распадом, что и было продемонстрировано в данной работе.
С помощью проведенных иммуногистохимических исследований удалось проследить морфологические изменения клеточного состава ЭРМ. Обнаружение α-SM актина во всех исследуемых образцах подтверждает факт того, что клетки с ЭРМ с течением времени начинают приобретать способность к сокращению и проявлять свойства фибробластоподобных элементов, которым принадлежит одна из ведущих ролей в процессе фиброзного преобразования макулярной области сетчатки. Следует отметить, что на начальных этапах и по мере прогр ессирования патологического процесса отмечается увеличение продукции виментина и α-SM актина с вовлечением все большего количества клеток в процесс ЭМТ. Так же происходит нарастание Snail + Slug, что говорит о нарастании феномена ЭМТ и увеличении числа клеток, подвергающихся данному процессу. На заключительной же стадии фиброзирования сетчатки выявлено большое количество компонентов экстрацеллюлярного матрикса в виде коллагенов IV и VI типов и выраженное снижение количества клеток, экспрессирующих GFAP, CRALBP и CD45. Такие изменения отмечали у пациентов 3-ей группы. Они свидетельствует о завершении процесса ремоделирования ткани. С течением времени происходит прогрессирование патологического процесса, что выражалось в прогрессирующем снижении остроты зрения.
Таким образом, на примере прогрессирования идиопатического эпиретинального фиброза прослежена эпителиально-мезенхимальная трансформация клеточного состава в мезенхимальный фенотип, выражающаяся в постепенном вовлечении в процесс все большего количества клеток, их активации и трансдифференциации в миофибробластоподобные клетки, что проявлялось увеличением экспрессии виментина, α-SM актина, Snail + Slug, снижением экспрессии маркеров глиальных клеток и гиалоцитов - GFAP, CD45, а также появлением способности клеток к продуцированию компонентов внеклеточного матрикса. Внеклеточный матрикс был представлен коллагенами VI и IV типов характерных для мембранной архитектоники.
