Рисунок 3.4 - Выполнение ТИАБ с портом (А) и без него (В) на энуклеированном глазу
Рисунок 3.5 - Морфологическое исследование фрагмента склеры после ТИАБ с портом
3.2.1. Оценка информативности материала ТИАБ для морфологического исследования
С целью оценки информативности материала ТИАБ для морфологического исследования был проведен сравнительный анализ 39 опухолей сосудистой оболочки глаза и материала ТИАБ от 39 пациентов с клинически установленным диагнозом УМ. Во всех случаях была выполнена энуклеация пораженных глаз, на энуклеированных глазах была проведена ТИАБ по описанной выше методике. По данным предоперационного B-сканирования, средняя проминенция образования у пациентов из данной группы составила 10,2 мм (от 5,8 мм до 15,2 мм), протяженность – 14,8 мм (от 9,1 мм до 19,8 мм). Вторичную отслойку сетчатки наблюдали в 37 случаях, средняя высота отслойки составила 4,6 мм (от 1,4 мм до 12,6 мм).
Информативность материала ТИАБ составила 100%: во всех 39 случаях с помощью ТИАБ был получен адекватный материал, пригодный для проведения цитологического исследования.
По результатам цитологического исследования в 36 случаях из 39 обнаружена картина, характерная для УМ; в остальных 3 случаях картина была менее однозначной, однако предполагала УМ как один из вариантов дифференциального диагноза. При гистологическом исследовании материала удаленного глаза цитологический диагноз УМ был подтвержден в 38 случаях из 39: в 1 случае был зафиксирован ложноположительный результат – хотя цитологическая картина свидетельствовала о возможной принадлежности опухолевых клеток к УМ, при гистологическом исследовании была выявлена аденома пигментного эпителия. При этом клинически опухоль также больше напоминала УМ – в глазу обнаруживалось пигментированное образование цилиохориоидальной локализации больших размеров (проминенция – 10,1 мм, протяженность – 14,4 мм), ставший причиной формирования вторичной некомпенсируемой глаукомы и тотальной отслойки сетчатки.
Чувствительность ТИАБ для морфологического исследования составила 97%.
В ходе цитологического исследования оценивали наличие в биоптате эпителиоидных клеток УМ, являющихся фактором неблагоприятного прогноза (см.главу «Разработка панели наиболее значимых для диссеминации увеальной меланомы маркеров в рамках технологии прогностической ТИАБ»). В 19 случае были обнаружены преимущественно веретенообразные клетки, в 16 случаях была выявлена значимая доля округлых (эпителиоидных) клеток, в оставшихся 3 случаях визуализировались немногочисленные полиморфные клетки УМ (клеточный тип определить не удалось). При гистологическом исследовании материала удаленного глаза веретеноклеточная УМ диагностирована в 22 случаях, эпителиоидная – в 4, смешанноклеточная – в 13. Чувствительность ТИАБ для морфологического исследования в отношении определения эпителиоидных клеток УМ составила 89,5%.
3.2.2. Оценка информативности материала ТИАБ для генетического исследования
С целью оценки информативности материала ТИАБ для генетического исследования был проведен сравнительный анализ 20 опухолей из данной группы. Во всех случаях была выполнена энуклеация пораженных глаз; на энуклеированных глазах была проведена ТИАБ по описанной выше методике. Высота образования, по данным предоперационного В-сканирования, в данной группе варьировалась от 2,3 мм до 13,7 мм (средняя – 10,0 мм), протяженность – от 10,8 мм до 19,8 мм (средняя – 15,2 мм). В 17 случаях отмечена экссудативная отслойка сетчатки, высота которой составила 4,6 мм (от 1,4 мм до 12 мм).
Цитологический и гистологический материал подготавливали для последующих тестов по описанной ранее методике. Молекулярную верификацию адекватности полученного материала осуществляли путем поиска драйверных молекулярных нарушений, характерных для УМ – мутаций в «горячих точках» экзонов 4 и 5 гена GNAQ и экзонов 4 и 5 гена GNA11 – в гистологическом и цитологическом материале (см.. Морфологическое и генетическое исследование опухолевого материала) Информативность материала ТИАБ составила 100%: во всех 20 случаях с помощью ТИАБ был получен адекватный материал, подходящий для проведения молекулярно-генетического исследования. Концентрация ДНК, выделенной из образцов УМ, составила 27,6 ± 24,24 нг/мкл для гистологических и 9,6 ± 17,14 нг/мкл для цитологических образцов. Качество ДНК во всех случаях было удовлетворительным.
Молекулярная верификация адекватности полученного материала путем тестирования на драйверные мутации дала положительный результат в 18 образцах ТИАБ из 20: в 12 случаях были обнаружены мутации в 5 экзоне гена GNAQ и в 6 случаях – в 5 экзоне гена GNA11. В 2 случаях из 20 в материале ТИАБ мутаций выявлено не было; в одном из этих случаев мутации не были обнаружены и в гистологическом материале, а во втором случае в гистологическом материале была обнаружена мутация в экзоне 5 гена GNAQ.
Результаты молекулярного тестирования парных образцов суммированы в таблице 3.2. Конкордантность между результатами молекулярно-генетического исследования материала ТИАБ и гистологического материала составила отмечена в 19 случаях из 20 (чувствительность - 95%).
3.2.3. Оценка локальной безопасности ТИАБ
Рисунок 3.6 - Морфологическое исследование фрагментов склеры после ТИАБ без портов
Таблица 3.2 Результаты молекулярного тестирования парных образцов УМ
Работа включала гистологическое исследование 44 участков склеры после трансвитреальной ТИАБ, выполненной в эксперименте на 22 энуклеированных глазах с клинически и инструментально диагностированной УМ, непосредственно сразу после завершения операции энуклеации. Энуклеация выполнялась при невозможности проведения органосохраняющего лечения.
В 13 случаях опухоль имела хориоидальную локализацию, в 9 – цилиохориоидальную. Высота опухоли по данным предоперационного B-сканирования варьировалась от 4,8 до 19,4 мм (средняя – 11,4 мм), протяженность – от 10,4 до 20,1 мм (средняя 14,4 мм). В всех случаях отмечена отслойка сетчатки высотой от 1,7 мм до 12,6 мм (средняя – 4,7 мм).
Непосредственно после проведения энуклеации глазу придавалось фиксированное положение для последующей ТИАБ. На каждом энуклеированном глазу ТИАБ выполнялась двумя техниками: с портом (рисунок 3.4 А) и без него (рисунок 3.4 В). Для выбора зон установки витреоретинального порта и выполнения склеротомии для иглы определяли локализацию опухоли методом непрямой офтальмоскопии и трансиллюминации.
При проведении ТИАБ в 27 случаях устанавливали витреоретинальный порт 25-27G с формированием двухпрофильного прокола через pars plana в 3,5-4 мм от лимба вне зоны проекции опухоли на склеру. Еще в 23 случаях ТИАБ выполняли без предварительной установки витреоретинального порта, когда биопсийная игла проходила непосредственно через склеру в 4 мм от лимба вне зоны проекции опухоли на склеру. Под контролем операционного микроскопа биопсийную иглу направляли к опухоли, проводили ее аспирацию. Полученный материал ТИАБ помещали в консервант для последующего проведения цитологического исследования. Склеральные каналы после извлечения иглы и порта маркировали шовным материалом и дополнительно помечали хирургическими маркерами различных цветов.
Удаленные глаза помещали в 10% раствор нейтрального формалина и для последующего морфологического исследования (см. Морфологическое и генетическое исследование опухолевого материала). При изучении гистопрепаратов склеральных участков оценивали форму склеральных каналов и наличие в них патологических клеточных элементов.
Во всех случаях материал, полученный в ходе ТИАБ, оказался пригодным для проведения цитологического исследования. По результатам гистологического исследования в 22 случаях из 22 была подтверждена УМ: в 15 случаях – веретеноклеточная УМ, в 5 – эпителиоидноклеточная, в 2 – смешанная.
В случаях проведения ТИАБ через витреоретинальный порт склеральный канал характеризовался дефектом двухпрофильной формы и нарушением параллельного хода склеральных волокон (рис. 3.5). Зияния канала не отмечено ни в одном случае. При анализе фрагментов склеры на предмет возможной имплантации клеток УМ после проведения манипуляции с предварительной установкой витреоретинального порта ни в одном случае из 22 в просвете канала не выявлено опухолевых или опухолеподобных клеток.
Склеральный канал после прокола инъекционной иглой характеризовался более узким в сравнении с портовой техникой профилем и однонаправленным ходом дефекта, что обусловлено линейным ходом иглы, а также отсутствием проводника, наружный диаметр которого превышает наружный диаметр биопсийной иглы. При этом зияния каналов не отмечено ни в одном случае. В группе фрагментов склеры после ТИАБ без порта в 5 случаях из 22 визуализированы группы клеток, подозрительных на опухолевые (рисунок 3.6). При этом в одном случае в просвете канала визуализирован тяж из веретеновидных клеток с пигментацией цитоплазмы, однако уверенно судить об их принадлежности к опухолевым или меланофорам сосудистой оболочки не представилось возможным. Кроме того, единичные группы из аналогичных клеток выявлены в стекловидном теле, прилежащем к внутренней части канала. Учитывая схожесть описанных групп клеток, клетки в биопсийном канале расценены как опухолевые.
В группе фрагментов склер после ТИАБ, выполняемой непосредственно через склеру, количество случаев имплантации опухолевых клеток в склеральный канал (n=5) оказалось статистически выше, чем при ТИАБ, выполняемой через порт (р=0,018, по критерию хи-квадрат Пирсона). Было показано, что выполнение ТИАБ при прямом доступе – пункции иглой непосредственно через склеру сопровождается статистически достоверно более высоким риском имплантации опухолевых клеток в склеральный канал. Использование витреоретинального порта в качестве проводника при ТИАБ позволяет снизить риск диссеминации опухолевых клеток по склеральному каналу.
Таким образом, информативность разработанной технологии ТИАБ в эксперименте составила 100%, чувствительность - 97%. Чувствительность ТИАБ по клеточному типу, когда тип клеток УМ в тонкослойном препарате соответствовал клеточному типу УМ в стеклопрепарате со срезами, составила х100 х100 х630 89,5%. Кроме того, предложенная технология ТИАБ позволяет получать материал, пригодный для молекулярно-генетического исследования опухоли без существенных искажений генетической информации. Генетическая информативность манипуляции составила 100%, чувствительность – 95%. Предложенный способ проведения ТИАБ через порт-проводник, как было показано в эксперименте, позволяет снизить риск имплантации опухолевых клеток в склеральный канал.
