3.2. Результаты оценки реакции культуры клеток стромы роговицы и кадаверной роговицы человека на введение экспериментальных образцов

.2.1 Результаты 2D культивирования клеток стромы роговицы человека в присутствии гелевых окрашенных имплантатов (in vitro)


    В работе была использована модель 2D клеточной культуры кератоцитов 3 пассажа (Рис. 7).


    Для подтверждения фенотипа полученной клеточной культуры было проведено иммуноцитохимическое исследование на характерные маркеры кератоцитов Кератокан, Кератан сульфат, Люмикан, а также неспецифический маркер - а-гладкомышечный актин. Полученные результаты показали, что исследуемая клеточная культура 3 пассажа экспрессирует характерные маркеры кератоцитов и неэкспрессирует а-гладкомышечный актин (Рис.8).


    Для изучения влияния исследуемых образцов имплантатов на 2D клеточную культуру кератоцитов оценивали два показателя: пролиферативную активность и повреждение ДНК. Морфология клеточной культуры после внесения образцов имплантата была трудно различима (Рис. 9).


    Пролиферативная активность клеточной культуры кератоцитов не отличалась между контрольной и опытными группами на всем протяжении эксперимента (Таблица 3).


    По итогам проведения эксперимента установлено, что ни один из образцов не оказывает воздействия на пролиферативную активность культуры клеток, а также не приводит к повреждению ДНК клеток.


    3.2.2. Результаты экспериментально-морфологического исследования влияния разработанных гелевых окрашенных имплантатов на роговицу человека


    Были исследованы инициаторные маркеры апоптоза каспазного пути - Caspasa 8 и митохондриального пути - BAX и Цитохром С. Данные белки относятся к начальным этапам апоптоза, когда процесс программируемой клеточной гибели носит обратимый характер. Для определения эффекторных белков апоптоза (необратимый этап) обоих путей были исследованы Caspasa 3/7.


    Показано, что экспрессия Цитохрома С и Caspasa 8 в роговицах с образцами имплантатов № 1 и 3 была сопоставимой и статистически выше (р<0,05) по сравнению с контрольной группой. При этом статистически значимых различий в роговицах с образцом 2 и контрольной группой выявлено не было (p>0,05) (рис. 11). В исследуемых образцах экспрессия инициаторного маркера митохондриального пути апоптоза BAX отсутствовала. Изучение экспрессии эффекторных маркеров Caspasa 3/7 показало отсутствие статистически значимых различий (рис. 14, табл 3-4).


    Данные представлены в формате M±σ, где М – среднее арифметическое, σ – стандартное отклонение (табл. 4-5).


    При сканирующем электронно-микроскопическом исследовании роговиц контрольной группы были выявлены незначительные различия в толщине стромальных коллагеновых волокон до и после культивирования, сформированный карман был слабо выражен (Рис. 17).


    Исследование образца №1 показало, что после культивирования детектируется частичное вымывание имплантата и образование волокнистой структуры в профиле сформированного кармана (Рис. 18)


    В роговицах с образцом №2 изменение толщины волокон не отмечалось, краситель полностью заполнял весь объём сформированного канала, новообразованных волокон обнаружено не было (Рис. 19).

    В исследуемых роговицах с образцом имплантата № 3 было выявлено уменьшение толщины коллагеновых волокон, также отмечалось значительное вымывание образца из интрастромального кармана, новообразованных волокон не отмечалось (Рис. 20).


    Таким образом, проведенное исследование показало, что ни один из образцов не оказывает воздействия на пролиферативную активность культуры клеток, а также не приводит к повреждению ДНК клеток.


    Проведенное иммуногистохимическое исследование кадаверной роговицы, культивируемой с исследуемыми образцами показало, что наилучшие результаты демонстрировал образец №2 по следующим критериям: слабая экспрессия инициаторных белков апоптоза Caspasa 8 и Цитохром С, отсутствие экспрессии ВАХ и эффекторных белков Caspasa 3/7.


    Согласно результатам электронно-микроскопических исследований, образцы №1 и №3 подвергаются частичному растворению и вымыванию из интрастромального кармана, образец №2 имеет плотную структуру и сохраняется в роговичном кармане на всем протяжении культивирования, как минимум в течение 7 суток. Ввиду этого, гелевый окрашенный имплантат на основе гидролизата коллагена может являться перспективным в качестве использования при проведении кератопигментации с лечебной диафрагмирующей целью.