3.3. Экспериментальное исследование качества формируемой поверхности ультратонкого трансплантата с использованием метода атомно-силовой микроскопии

     В эксперименте было взято 5 пар кадаверных корнеосклеральных дисков, всего 10 роговиц с показателем трансплантабельности 3А.

    Первая группа – 5 кадаверных корнеосклеральных дисков, из которых заготовили ультратонкие роговичные трансплантаты с помощью механического микрокератома Moria LSK-One (Moria, Франция). Корнеосклеральный диск монтировали на искусственную переднюю камеру, подключенную к инфузионной системе, внутри которой создавали давление 50 см вод. ст. Выполняли ОКТ пахиметрию (Optovue, США). Затем использовали механический микрокератом Moria LSK-One (Moria, Франция) с турбиной продольного типа. В зависимости от исходной толщины роговицы во всех случаях применяли методику двух резов с использованием различных головок (450 мкм, 400 мкм, 250 мкм, 200 мкм, 130 мкм). После этого выполняли повторную ОКТ пахиметрию в центральной и периферической зонах трансплантата. Итоговая толщина трансплантатов находилась в диапазоне от 120 до 130 мкм в центральной зоне. Сканировали поверхность, конгруэнтную поверхности трансплантата.

    Вторая группа – 5 кадаверных корнеосклеральных дисков из этих же пар, из которых заготовили ультратонкие роговичные трансплантаты с применением ФСЛ «Фемто Визум». Трансплантат отделяли от стромы роговицы шпателем. Сканировали поверхность, конгруэнтную поверхности трансплантата.

    Возможности классической оптической микроскопии не безграничны и обусловлены ограничениями в разрешающей способности по причине наличия дифракционного предела.

    В 1981 г. Бинниг Г. и Рорер Г. разработали технологию сканирующей туннельной микроскопии, позволяющей преодолеть физические ограничения оптической микроскопии и перейти к изучению объектов на молекулярном уровне. Позднее в 1986 г. Рорер Г. разработал первый в мире атомно-силовой микроскоп (АСМ). Принцип сканирующей зондовой микроскопии заключается в сканировании поверхности образца сверхтонким зондом с толщиной кончика порядка нескольких нанометров, называемым кантилевером. При этом происходит измерение сил Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий, т.е. электростатического притяжения или отталкивания. Именно измерение сил межмолекулярных взаимодействий позволяет использовать АСМ для работы с непроводящими биологическими образцами.

    Образцы первой и второй групп помещали в 10% формалин. Непосредственно перед исследованием их подвергали сушке в эксикаторе по стандартной методике. Технические аспекты атомно-силовой микроскопии были следующими: сканирующий зондовый микроскоп Certus V (Nano Scan Technologies, Россия), сканирующая головка Certus. В основном режиме Certus работает как атомно-силовой микроскоп. Образцы подвергались анализу в контактном режиме в воздушной среде.

    При микроскопии использовали зонды для контактной атомно-силовой микроскопии MSCT-AUNM (Veeco, США) с жесткостью балки 0,01 Н/м и радиусом кривизны зонда 10 нм. Количественный морфометрический анализ проводили с использованием штатного программного обеспечения микроскопа.

    Изображения программными средствами распрямляли по осям Х, Y перед расчетом параметра RMS (среднеквадратичной шероховатости поверхности). При этом в случае каждого из образцов анализировали не менее 5 изображений площадью 400 мкм² (20x;20 мкм).

    3.3.1. Оценка качества формируемой поверхности ультратонкого трансплантата с использованием метода атомно-силовой микроскопии

     Методом атомно-силовой микроскопии было необходимо оценить, насколько велик уровень шероховатости поверхности, получаемой тем или иным способом. Чем меньше уровень шероховатости, тем более гладко сформирована поверхность, тем предпочтительнее трансплантат.

    В первой группе, где трансплантат был сформирован при помощи кератома (Moria LSK-One, Франция), значение среднеквадратичной шероховатости поверхности (RMS) составило в среднем 22,3±18,3 мкм (Рисунок 9).

    Во второй группе, где ультратонкий трансплантат был выкроен при помощи ФСЛ «Фемто Визум» значение среднеквадратичной шероховатости составило в среднем 18,7±12,0 мкм (Рисунок 10).

    Статистический анализ не выявил статистически значимые различия между значениями исследуемого параметра в указанных группах (p=0,753).

    Таким образом, методом атомно-силовой микроскопии был оценен поверхностный рельеф роговичной ткани, выполняющей роль трансплантатов, вычислены величины шероховатости для ультратонких трансплантатов, заготовленных при помощи микрокератома и фемтосекундного лазера.

    Значения параметров среднеквадратичной шероховатости поверхности в 1-й группе (микрокератом) и во 2-й группе (ФСЛ «Фемто Визум») были на оптимальном уровне и сопоставимы между собой. Это говорит о высоком качестве получаемой поверхности заготовленных различными способами трансплантатов и обуславливает возможность их использования в клинике.