3.3 Особенности выделения и культивирования МСК жирового тела глазницы

     В данном подразделе работы представлены результаты выделения, культивирования и изучения МСК, выделенных из образцов ЖТГ.

    3.3.1 Разработанная методика выделения МСК жирового тела глазницы и характеристика полученных клеток

    С использованием стандартной методики выделения МСК из жировой ткани первичную культуру жизнеспособных фибробластоподобных колониеобразующих клеток, адгезивных к культуральному пластику, из ЖТГ удалось выделить только в одном случае из 11 образцов кадаверного ЖТГ (рисунок 13).

    Стрелками указаны фибробластоподобные колониеобразующие клетки

    Такой результат свидетельствовал о низкой жизнеспособности МСК и не позволил использовать фрагменты кадаверного ЖТГ в качестве стабильного источника для экспериментально-клинических исследований, что определило необходимость использования интраоперационно резецированных фрагментов ЖТГ для выделения МСК.

     На этапе отработки методики выделения МСК из 11 образцов ЖТГ, резецированных интраоперационно, при условии хранения образцов в физиологическом растворе с антибиотиками при температуре 4 °С до пяти часов с момента резекции, были получены жизнеспособные фибробластоподобные колониеобразующие клетки, адгезивные к пластику во всех 11 случаях (таблица 4).

    В то же время из двух образцов интраоперационно резецированного ЖТГ, хранившихся при тех же температурных условиях, но более длительно (24 часа), необходимую клеточную культуру выделить не удалось (таблица 4).

    Модифицированная методика выделения МСК (см. раздел 2.5.1.3) позволила получать из 0,2 мл ЖТГ от 0,4х10₆ до 1,0х10₆клеток через 7–10 дней культивирования, в отличие от стандартной методики, обеспечивавшей получение не более 0,4х10₅ клеток за аналогичный период времени. Получение дополнительного количества фибробластоподобных колониеобразующих клеток происходило за счет активной миграции этих клеток из фрагментов тканевого дебриса (рисунок 14), помещенных в культуральный флакон наряду с осадком стромально-клеточной фракции. Клетки, выделенные с использованием модифицированной методики, характеризовались специфичной фибробластоподобной формой (рисунок 14, 15 а), адгезией к культуральному пластику и спонтанной дифференцировкой в адипоциты (рисунок 15 б, в).

    Стрелкой указан фрагмент тканевого дебриса, на его периферии фибробластоподобные клетки

    Иммунофенотипирование методом проточной цитофлуориметрии показало, что полученная культура клеток была представлена клетками CD9 + /CD10 + /CD13 + /CD19 -/CD29 + /CD34 ± /CD44 + /CD73 + /CD90 ± /CD105 + /CD117 -/ CD166 + (рисунок 16). Совокупность культуральных и иммунофенотипических характеристик позволила идентифицировать получаемые с помощью модифицированной методики клетки как МСК.

    Таким образом, проведенный сравнительный анализ условий выделения и жизнеспособности МСК показал, что интраоперационно резецированные фрагменты ЖТГ при хранении в условиях гипотермии не более пяти часов являются предпочтительным источником для выделения МСК, по сравнению с образцами кадаверного ЖТГ. Использование модифицированной методики выделения клеток позволяет даже из малого (0,2 мл) объема ЖТГ получать до 1,0х10₆ клеток через 7–10 дней культивирования. При этом выделяемая культура клеток соответствовала основным критериям отнесения к МСК и использовалась в дальнейших экспериментах in vitro.

    3.3.2 Секреторная активность МСК жирового тела глазницы

     По результатам иммуноферментного анализа на 2-е сутки культивирования VEGF A определялся только в 14 образцах кондиционированной питательной среды (таблица 5). При этом на 5-е сутки культивирования VEGF A был обнаружен уже во всех образцах, хотя диапазон концентраций был статистически значимо ниже (р=0,025).

    Количественные значения концентраций цитокинов, представленные в таблице 5, свидетельствуют о том, что для TGF-β 2 в тех же клеточных культурах были характерны более низкие концентрации. При этом в большинстве образцов (не включены в таблицу) они оказались ниже порога чувствительности тест-системы. Обратило на себя внимание, что в двух образцах питательной среды от МСК, выделенных из верхней медиальной фракции ЖТГ («белый» жир), отмечалась более активная секреция TGF-β 2, зафиксированная уже на 2-е сутки культивирования.

    Таким образом, на этапе изучения секреторной активности МСК, выделенных из ЖТГ, показано, что в кондиционированной питательной среде, полученной при культивировании этих клеток на протяжении пяти суток, определяются VEGF A и TGF-β 2. Данный факт позволяет предположить, что при сокультивировании с фрагментами ПЖТ в модели сотрансплантации in vitro МСК будут оказывать положительное влияние на поддержание жизнеспособности клеток ПЖТ.