3.3 Результаты конструирования и культивирования 3D сфероидов ретинального пигментного эпителия для трансплантации

     Для конструирования 3D сфероидов использовали клетки РПЭ Р1 из 1-й опытной группы. В первые 3 часа 3D культивирования в лунках агарозных планшетов под действием сил гравитации происходило медленное оседание клеток РПЭ. Параллельно с этим, в результате активного клеточного движения и клеточной адгезии, формировалась неопределенная клеточная масса РПЭ, состоящая из множества мелких агрегатов.

    На 1-е сутки 3D культивирования формировались первые сфероиды РПЭ – по одному крупному или по несколько сфероидов среднего размера в одной лунке, которые в дальнейшем сливались в один большой сфероид. На 3-й день 3D культивирования во всех лунках агарозных планшетов наблюдали формирование («сборку») одного большого сфероида РПЭ с гладкой поверхностью и умеренным количеством клеточного дебриса. На 7-е сутки 3D культивирования визуализировали формирование «гладких» сфероидов РПЭ, клеточный дебрис практически отсутствовал. В последующие сроки наблюдения форма и внешний вид трехмерных культур РПЭ оставались стабильными, отмечалось незначительное увеличение количества клеточного дебриса по мере увеличения сроков наблюдения.

    Полученные многоклеточные микроагрегаты РПЭ имели приближенную к сфере, но все же неправильную форму. Известно, что объекты неправильной трехмерной формы не могут быть всесторонне описаны одним измерением. Для правильного измерения диаметра сфероидов применяли максимальный диаметр Ферета – результат одного измерения каждого объекта по его произвольной проекции, т.е. максимально возможное расстояние между двумя точками видимой на фотографии проекции сфероида.

    При попарном применении t-критерия оказалось, что сфероиды статистически значимо уменьшались в диаметре в течение 1-й недели (во всех случаях p<0,05 при сравнении диаметра сфероидов одного посевного количества), и в дальнейшем не претерпевали статистически значимых изменений (p>0,05 при сравнении диаметра сфероидов одного посевного количества на 7-е и 10-е, 10-е и 14-е, 14-е и 17-е, 17-е и 20-е, 20-е и 30-е сутки).

    Анализ диаметра сфероидов позволил оценить возможность их трансплантации в субретинальное пространство при помощи современного хирургического инструментария для витреоретинальной хирургии. Так, при сравнении диаметра «гладких» сфероидов на 7-е и последующие сутки, было подтверждено, что полученные клеточные трансплантаты могут быть инъецированы субретинально через канюли минимального диаметра – 38-40G. Следовательно, 1000 клеток РПЭ в одном сфероиде является оптимальным количеством. В таблице 10 представлены результаты измерения диаметра 3D сфероидов РПЭ на различных сроках культивирования. Результаты измерений диаметра 3D сфероидов РПЭ оказались сопоставимыми с результатами авторов, полученных раннее при исследовании сфероидов, сконструированных из человеческого РПЭ.