Рисунок 39 – Распределение (%) живых и мертвых клеток в контрольной и опытной группах
Рисунок 40 – Сравнение индекса «ДНК-комет» (усл. ед) для отрицательного контроля UV, опыта и контроля
- Выживаемость кератоцитов в присутствии криоконсервированного образца после децеллюляризации с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания маркером «Live and Dead»
- Изучение токсического воздействия криоконсервированного образца после децеллюляризации на кератоциты с помощью метода определения повреждения ДНК – метод «ДНК-комет»
- Жизнеспособность кератоцитов в присутствии криоконсервированного ЛМ после децеллюляризации с помощью МТТ–теста
3.3.1. Результаты теста «Live and Dead»
Исследование на цитотоксичность полученной культуры кератоцитов в присутствии ДЛМ после хранения в ДМСО (NaCl-ДМСО) проводили с помощью проточного цитофлуориметра с применением набора «Live and Dead» (Рисунок 39).
Во время проведения лазерной сканирующей конфокальной микроскопии после окрашивания суспензии в контрольных и опытных лунках планшета маркером «Live and Dead» было выявлено, что культура клеток в присутствии ДЛМ после криозамораживания сохраняет свою жизнеспособность в течение 3 суток наблюдения. Опытные группы в основном были представлены жизнеспособными клетками. Количество мертвых клеток было минимально и не превышало критических значений (Таблица 19).
3.3.2. Результаты метода «ДНК комет»
Рисунок 41 – График оценки жизнеспособности опытной и контрольной групп на 1, 3, 5, 7, 9 сутки исследования
Таблица 19 – Количество (%) живых и мертвых клеток в лунках, содержащих контрольную и опытную группу
Анализ полученных результатов «ДНК-комет» показал, что ДЛМ после хранения в ДМСО (NaCl-ДМСО) не вызывают выраженных процессов гибели культивируемых клеток (Таблица 20).
Контроль UV – клеточная культура с питательной средой, которая находилась в экспозиции под ультрафиолетом в течение 10 минут (уровень максимально возможной гибели клеток). Для опыта использовали суспензию клеток, состоящей в прошлом из обработанного ЛМ и культуры кератоцитов. (Рисунок 40). Для контроля использовали культуру кератоцитов с питательной средой.
3.3.3. Результаты МТТ-теста
МТТ–анализ отражает интенсивность окислительно-восстановительных процессов в клетках. Учитывая, что только клетки с живыми митохондриями могут осуществлять метаболические процессы, в этой связи интенсивность окрашивания зависит от степени неповрежденности митохондрий. Измерение концентрации формазана в растворе после взаимодействия с изопропанолом–2 позволяет оценить количество жизнеспособных клеток. Результаты МТТ-анализа представлены в графическом виде, где показано количество жизнеспособных клеток для опытной и контрольной групп в течение 9 суток наблюдения (Рисунок 41).
Результаты МТТ–теста в течение 9 суток наблюдения показали отсутствие токсических воздействий как в опытной группе, так и в контрольной группе. Напротив, количество жизнеспособных клеток в контроле и в опыте увеличивалось с течением времени наблюдения (Таблица 21).
Таким образом, было установлено, что при культивировании кератоцитов в присутствии криоконсервированного лентикулярного материала после децеллюляризации (1.5М NaCl с нуклеазами в ДМСО) жизнеспособность клеток сохраняется в течение 9 суток по данным МТТ-теста (опыт – 1 сутки: 20.000; 20.000; 20.000, 9 сутки: 160.000; 165.000; 166.000; контроль – 1 сутки: 20.000; 20.000; 20.000, 9 сутки: 129.800; 125.000; 126.000). По результатам тестирования «Live and Dead» (опыт – живые клетки (%) 86; 89; 91 и «мертвые» клетки (%) 14; 11; 9, контроль – живые клетки (%) 95; 92; 89 и «мертвые» клетки (%) 5; 8; 11) и метода «ДНК-комет» (опыт – 0,6253 усл. ед, контроль – 0,5698 усл. ед) установлено, что кератоциты сохраняли свою жизнеспособность в течение 3-х суток наблюдения, количество «мертвых» клеток было наименьшим и не превышало уровня критических значений. На основании проведенных культуральных и имммунногистохимических методов исследований, были изучены цитотоксические свойства криоконсервированного лентикулярного материала после децеллюляризации. Протокол криоконсервации ДЛМ (1.5МNaCl с нуклеазами в ДМСО) не вызывает токсического воздействия на кератоциты, в связи с чем, данный протокол может быть рекомендован для будущего его применения в клинике.
При подведении итогов по 3-ей главе настоящего исследования был разработан протокол криоконсервации децеллюляризированного лентикулярного материала, позволяющий получать прозрачную, ацеллюлярную ткань с сохранненным коллагенновым каркасом при отстутствии выраженного цитотоксического воздействия на кератоциты в эксперименте in vitro. Это дало возможность перейти к следующему этапу диссертационного исследования – имплантации криоконсервированного ДЛМ в строму роговицы с целью коррекции гиперметропии, на основе разработанных математической формулы и диаграммы.
