3.3.Результаты разработки критериев оценки трансплантабельности сфероидов ретинального пигментного эпителия

     Протокол трехмерного культивирования, разработанный на втором этапе исследования, дал возможность конструировать сфероиды РПЭ различного размера и морфологии. Для изучения критериев трансплантабельности 3D клеточных сфероидов ретинального пигментного эпителия, подготовленных по предложенной технологии, использовали два критерия трансплантабельности сфероидов – жизнеспособность составляющих сфероид клеток и адгезивные свойства сфероидов по отношению к стандартному субстрату (культуральный пластик). Первый критерий является отражением базовой функции клетки – ее способности поддерживать целостность плазматической мембраны, которая в норме непроницаема для трипанового синего. Второй критерий является отражением частной функции эпителиальной клетки – ее способности синтезировать белки адгезии интегрины.

    На третьем этапе работы исследовали трансплантабельность сфероидов различной морфологии («гладкие» и «бахромчатые»), различных сроков предтрансплантационного 3D культивирования и различных посевных количеств клеток.

    Результаты исследования жизнеспособности и адгезивных свойств сфероидов с различными параметрами представлены в разд. 3.3.

     3.3.1. Результаты оценки жизнеспособности клеток ретинального пигментного эпителия в составе сфероидов

    В таб. 21 представлены данные изучения жизнеспособности сфероидов с различными параметрами. Та же информация представлена в графическом виде на рис. 17 и 18.

    При анализе влияния сроков 3D культивирования на жизнеспособность сфероидов выяснилось, что сфероиды с большими посевными количествами клеток (25000 и 125000 клеток) статистически значимо (P<0,05) снижали свою жизнеспособность к 28 дню 3D культивирования по сравнению со сфероидами 7 дней 3D культивирования. «Гладкие» сфероиды с меньшими посевными количествами клеток (500, 1000 и 5000 клеток) сохраняли жизнеспособность вплоть до 28 дня 3D культивирования, P>0,05.

    При анализе влияния изначальных посевных количеств клеток на жизнеспособность сфероидов выявлено, что клетки РПЭ в составе «гладких» сфероидов с посевными количествами 500 и 1000 клеток статистически достоверно не отличалась по жизнеспособности (P>0,05), однако при посевных количествах 5000 клеток и более на висячую каплю наблюдали статистически достоверное ее снижение, P<0,05. У «бахромчатых» сфероидов жизнеспособность достоверно снижается при посевных количествах 25000 клеток и более, P<0,05.

     При анализе зависимости жизнеспособности составляющих сфероиды клеток от их морфологии выяснилось, что жизнеспособность «бахромчатых» сфероидов достоверно ниже жизнеспособности «гладких» при низких посевных количествах (500, 1000, 5000 клеток), P<0,05. В то же время «гладкие» и «бахромчатые» сфероиды высоких посевных количеств статистически достоверных отличий не имеют, P>0,05.

    Достоверных различий между двумя группами сфероидов, отличающимися показателями адреналиновой пробы донорских глаз, явившихся первичными источниками клеточного материала, выявить не удалось, P>0,05.

    3.3.2. Результаты изучения адгезивных свойств сфероидов с различными параметрами

    Прикрепление «гладких» сфероидов к поверхности субстрата наблюдали уже в первые сутки 2D культивирования сфероидов (таб. 22). В то же время не было зарегистрировано ни одного случая прикрепления «бахромчатых» сфероидов. На вторые сутки сфероиды с меньшими посевными количествами клеток (500, 1000 и 5000 клеток) остались прикрепленными, в то время как часть сфероидов с большими посевными количествами клеток открепились (таб. 23). В последующие дни все прикрепившиеся сфероиды оставались прикрепленными, а новых прикреплений не наблюдалось. Информация представлена графически на рис. 19 и 20.

    При анализе достоверности различий в адгезивных свойствах сфероидов в зависимости от сроков предтранспланционного 3D культивирования выявили, что достоверное снижение адгезивных свойств сфероидов наблюдается в группах сфероидов с длительными сроками 3D культивирования и при больших посевных количествах клеток (25000 и 125000 клеток), P<0,05. В группах с меньшими посевными количествами клеток на висячую каплю достоверных изменений адгезивных свойств не выявлено (прикрепились все сфероиды, независимо от сроков 3D культивирования), P>0,05.

     При анализе достоверности различий в адгезивных свойствах сфероидов с различными посевными количествами клеток выявили, что достоверно более слабыми адгезивными свойствами обладают сфероиды с большими посевными количествами клеток (25000 и 125000 клеток на висячую каплю), P<0,05.

    Сфероиды с меньшими посевными количествами (1000 и 5000 клеток) достоверных отличий от сфероидов с наименьшей посевной концентрацией (500 клеток) не имели, P>0,05.

    При анализе различий в адгезивных свойствах сфероидов, полученных из донорских яблок с различными показателями адреналиновой пробы, достоверных различий выявлено не было, P>0,05.

    Таким образом, на третьем этапе работы было выявлено, что статистически достоверно большими показателями жизнеспособности составляющих клеток и адгезивными свойствами обладают сфероиды, полученные при 3D культивировании висячих капель с исходными посевными количествами 500 и 1000 клеток РПЭ на каплю, культивированные в трехмерных условиях в течение 7-14 дней и обладающие «гладкой» поверхностью; значения показателя адреналиновой пробы по Борзенку СА донорских глаз, послуживших первичным источником клеточного материала, статистически достоверного влияния на жизнеспособность клеток в составе сфероидов и их адгезивные свойства не оказали.