3.4. Определение начальной пороговой коллагенолитической дозы и исследование цитотоксичности коллагеназы в расширенном диапазоне дозы и экспозиции

    Определение начальной коллагенолитической дозы препарата и цитотоксичности коллагеназы важно с точки зрения определения степени потенциальной опасности токсического воздействия препарата в аспекте его практического применения. Чем больше разница между пороговой, эффективной дозой препарата и цитотоксической дозой, тем меньше степень опасности цитотоксического воздействия препарата. Для решения поставленной задачи необходимым было определить начальную дозу коллагеназы и исследовать цитотоксичность коллагеназы в широком диапазоне дозы и экспозиции.

    3.4.1. Определение начальной пороговой дозы коллагеназы и изменение эффекта воздействия в зависимости от дозы препарата

    Исследование проводили с целью определения начальной пороговой дозы протеолитического воздействия бактериальной коллагеназы на фибриллы СТ в эпиретинальном слое СТ. Перед исследованием проводили предварительное препарирование. С поверхности сетчатки отделяли кортикальное СТ, после чего подвергали препарат воздействию бактериальной коллагеназы, фиксировали для последующей электронной микроскопии.

    Фото сканирующей электронной микроскопии препарата после воздействия бактериальной коллагеназы. Фронтальная проекция (Рисунок 3.17).

    После воздействии раствора коллагеназы в концентрации 1 КЕ на 1 мл с экспозицией в 20 мин не зарегистрировано явных изменений в структуре волокон эпиретинального СТ. Его структура осталась практически неизменной. Эпиретинальное СТ состояло из густо переплетенных длинных волокон, имело однородную организацию и структуру, вместе с этим зарегистрированы отдельные единичные каплевидные структуры на некоторых фибриллах СТ (Рисунок 3.17а). С учетом последующих выявленных изменений после увеличения дозировки, указанные изменения интерпретированы как начальное проявление воздействия коллагеназы.

    После увеличения концентрации коллагеназы до 5 КЕ на 1 мл с экспозицией в 20 мин зарегистрированы следующие изменения в эпиретинальном СТ: отмечено увеличение числа каплевидных структур на фибриллах СТ, по толщине сравнимых с толщиной фибрилл. Изменений общей структуры волокон и плотности их организации не происходило (Рисунок 3.17б). Каплевидные структуры были интерпретированы как каплевидная агрегация фрагментов фибрилл СТ под воздействием коллагеназы – начальные проявления лизиса коллагеновых структур под воздействием фермента.

    Последующее увеличение концентрации фермента до 15 КЕ и 30 КЕ с экспозицией 10 и 20 мин приводило к полной потере волокнистой структуры эпиретинального СТ, дальнейшему уменьшению его толщины и последующей полной структурной дезорганизации (Рисунок 3.18).

    Таким образом, проведенные экспериментальные исследования показали, что ферментное воздействие на эпиретинальное СТ в дозе 1 КЕ на 1 мл с экспозицией в 20 минут вызывает минимальные видимые изменения в эпиретинальном СТ в виде формирования каплевидных структур на фибриллах СТ. Более заметные проявления воздействия в виде увеличения числа каплевидных структур на волокнах СТ выявляются при концентрации фермента в 5 КЕ на 1 мл и экспозиции 20 мин. Дальнейшее увеличение концентрации фермента и экспозиции воздействия приводили к прогрессирующим изменениям эпиретинального СТ вплоть до его полной дезорганизации. Начальная пороговая доза воздействия препарата бактериальной коллагеназы «Коллализин» на эпиретинальное СТ при кратковременном воздействии составила 1 КЕ на 1 мл.

    3.4.2. Результаты исследования цитотоксичности бактериальной коллагеназы в расширенном диапазоне дозы и экспозиции на фармакокинетической модели доза-эффект зависимости в аспекте ее интравитреального применения

    Протеолитический фермент бактериальной коллагеназы «Коллализин» – узко специфический коллагенолитический препарат отечественного производства. По результатам проведенных экспериментальных исследований показана очевидная перспектива его применения для лечения ВМТ. Ранее исследований цитотоксичности препарата в широком диапазоне дозы и экспозиции в аспекте интравитреального применения не производилось. Необходимо было изучить диапазон цитотоксичности препарата в зависимости от дозы и экспозиции, определить безопасную в аспекте цитотоксичности максимальную дозу и экспозицию препарата.

    Для исследования цитотоксичности бактериальной коллагеназы была использована клеточная фармакокинетическая модель доза-эффект зависимости цитотоксической реакции. В исследовании решались следующие задачи: определение общего диапазона цитотоксичности препарата в аспекте изменения цитотоксичности в зависимости от дозы и экспозиции и определение безопасной пороговой дозы при максимальной экспозиции препарата.

    Проведено исследование цитотоксичности препарата «Коллализин» производства Санкт-Петербургского НИИ вакцин и сывороток. Исследовались возрастающие дозы и экспозиция препарата для определения отношений «доза-реакция» на культуре фибробластов мыши линии NIH 3Т3. Исследования проведены на базе Института медико-биологических исследований и технологий АНО «Имбиит» в соответствии с ГОСТ Р ИСО 10993.5-99 Часть 5. «Исследование на цитотоксичность: методы in vitro». Исследовалась цитотоксичность различных доз препарата: 5 КЕ/100 мкл (50 КЕ на 1 мл), 15 КЕ/100 мкл (150 КЕ на 1 мл), 30 КЕ/100 мкл (300 КЕ на 1 мл), 40 КЕ/100 мкл (400 КЕ на 1 мл), 60 КЕ/100 мкл (600 КЕ на 1 мл), 80 КЕ/100 мкл (800 КЕ на 1 мл), 120 КЕ/100 мкл (1200 КЕ на 1 мл) с возрастающим временем экспозиции 10 мин, 20 мин, 30 мин, 1 час, 3 часа, 24 часа.

    Полученные результаты цитотоксической реакции культуры фибробластов мыши линии NIH 3Т3 интерпретировали с использованием таблицы «Степень ответной реакции клеток» (Таблица 3.1).

    Проведенные испытания показали, что концентрация препарата «Коллализин», не превышающая дозировку 15 КЕ в 100 мкл/лун (150 КЕ на 1 мл), в условиях данного эксперимента не оказывает цитотоксического действия на культуру фибробластов мыши линии NIH 3Т3 даже через 24 ч инкубации. Через 5 и 10 мин после инкубации все исследуемые концентрации не оказывает цитотоксического действия на культуру фибробластов. Через 30 мин, 1 ч и 3 ч все концентрации препарата, начиная с дозировки 30 КЕ в 100 мкл/лун (300 КЕ на 1 мл) оказывают незначительное цитотоксическое действие на фибробласты. Через 24 ч незначительное цитотоксическое действие сохраняется при концентрации 30 КЕ в 100 мкл/лун (300 КЕ на 1 мл). При концентрациях 40-120 КЕ в 100 мкл/лун (400-1200 КЕ на 1 мл) наблюдается нерезкая цитотоксичность (Таблица 3.2).

    Результаты исследований цитотоксичности препарата «Коллализин» на культуре фибробластов мыши в дозировке от 15 до 120 КЕ/100 мкл (от 150 до 1200 КЕ на 1 мл) указывают на умеренную цитотоксичность препарата при максимальной дозировке и экспозиции, что в целом положительно характеризует сам препарат с точки зрения его переносимости в аспекте потенциального токсического воздействия. График зависимости изменения концентрации и экспозиции от появления и нарастания эффектов негативного воздействия представлен на Рисунке 3.19.

    При дозировке препарата 15 КЕ/100 мкл (150 КЕ на 1 мл) и максимальной экспозиции не зарегистрировано признаков токсического воздействия.

    Концентрация, приводящая к появлению эффекта негативного воздействия в виде незначительной токсической реакции, зарегистрирована при дозе препарата 30 КЕ/100 мкл (300 КЕ на 1 мл) и экспозиции 30 минут, без последующего нарастания токсической реакции со временем. Концентрация нарастания токсического эффекта от нулевой до нерезкой токсической реакции зарегистрирована при дозах препарата от 40 до 120 КЕ/100 мкл (от 400 до 1200 КЕ/1 мл). После 30-минутной экспозиции регистрировалась незначительная токсическая реакция, которая к 24 часам экспозиции возрастала до нерезкой. Следует обратить дополнительное внимание, что при этом не происходило дальнейшего нарастания токсической реакции несмотря на увеличение дозы препарата от 40 к 120 КЕ/100 мкл (от 400 до 1200 КЕ на 1 мл) (см. Рисунок 4.10). Отсутствие прямой линейной зависимости от увеличения дозы препарата и степени ответной реакции клеток указывает на изначально низкую цитотоксичность коллагеназы.

    Таким образом, фармакокинетическая модель доза-эффект зависимости цитотоксической реакции на препарат «Коллализин» показала полное отсутствие цитотоксичности при дозировке препарата 15 КЕ/100 мкл (150 КЕ/1 мл), нарастание цитотоксической реакции до незначительной при дозировке в 30 КЕ/100 мкл (300 КЕ/1 мл), увеличение реакции до нерезкой при увеличении дозировки от 40 до 120 КЕ/100 мкл (от 400 до 1200 КЕ/1 мл) и отсутствие дальнейшего нарастания ответной клеточной реакции несмотря на увеличение дозы. Экстраполяция модели из условий in vitro в in vivo позволила прийти к заключению, что дозировка препарата до 15 КЕ/100 мкл (150 КЕ/1 мл) не несет в себе потенциальной опасности токсического воздействия на биологические ткани при максимальной экспозиции. Доза в 30 КЕ/100 мкл (300 КЕ/1 мл) может оказать незначительное токсическое воздействие на окружающие ткани при условии максимальной экспозиции. Основываясь на результатах токсикологических исследований, можно заключить, что применение препарата в клинике, при условии максимальной экспозиции не несет в себе риска токсического воздействия препарата при его дозировке до 15 КЕ/100 мкл (150 КЕ/1 мл).

    Результаты экспериментальных и токсикологических исследований отечественного препарата бактериальной коллагеназы «Коллализин» в аспекте интравитреального применения показали следующее: препарат бактериальной коллагеназы способен растворять коллагеновые фибриллы СТ человека, оказывает лизирующее воздействие на эпиретинальное СТ. Исследования подтвердили высокую специфичность бактериальной коллагеназы, оказывающей воздействие только на коллагеновые структуры. Бактериальная коллагеназа не оказывает воздействия на интраретинальные структуры сетчатки (палочки и колбочки сетчатки, пигментный эпителий). Начальная пороговая доза воздействия препарата бактериальной коллагеназы на эпиретинальное СТ при кратковременной экспозиции в эксперименте составила 1 КЕ на 1 мл.

    Объем СТ человека при нормальной длине глаза в среднем составляет 4 мл [144]. При экстраполяционном пересчете полученных данных о безопасной, нетоксичной дозе коллагеназы на объем витреальной полости нормального глаза безопасная, нетоксичная доза коллагеназы составляет 885 КЕ на объем витреальной полости при длительной экспозиции. По совокупности экспериментальных и токсикологических исследований коллагеназы дозировка препарата от 1 до 5 КЕ на витреальную полость находится далеко за пределами опасности токсического воздействия на ткани глаза, т. к. доза препарата в 5 КЕ 160 раз меньше безопасной токсической дозы и может рассматриваться, как ориентир для применения препарата в клинической практике для лечения ВМТ.