3.4 Результаты исследований морфо-функциональных характеристик 3D сфероидов ретинального пигментного эпителия

     На данном этапе исследовали процесс реконструкции слоя РПЭ in vitro при помощи многоклеточных сфероидных микроагрегатов РПЭ – изучали процесс спрединга слоя клеток РПЭ, образующегося вокруг адгезирующихся к субстрату сфероидов, и давали качественное и количественное описания наблюдаемых явлений.. Адгезия сфероидов и распространение (спрединг) вокруг него слоя клеток – важнейшие составляющие процессов приживления трансплантатов РПЭ.

    Сфероиды, полученные из клеток РПЭ Р1 в 1-й опытной группе, переносили из агарозных планшетов на культуральные матрасы и заливали 5 мл питательной среды стандартного состава. Для исследования использовали сфероиды на 4-е, 7-е и 11-е сутки культивирования.

    Во всех опытных группах уже спустя 3 часа с помощью метода перкуссии отмечали адгезию большинства сфероидов (65%). На 1-е сутки сфероиды прикреплялись к поверхности дна лунок культуральных планшетов и в течение последующих дней «распластывались», образуя вокруг изначальной зоны прикрепления слой клеток пигментного эпителия.

     Образуемые слои клеток были неоднородными. В центре клеточного слоя находился остаток сфероида («ядро» клеточного слоя). Непосредственно возле «ядра» образовывался пояс многоклеточного РПЭ шириной 50-200 мкм, плавно переходящий в монослой клеток РПЭ. Все три зоны появлялись отчетливо к концу 1-й недели 2D культивирования сфероидов и выявлялись вплоть до 14 дня. По своей морфологии клетки образуемого периферического монослоя имели форму, близкую к гексагональной, и имели пониженное содержание пигмента. Слой клеток распространялся неограниченно, достигая стенки культурального матраса. Распространение клеточных монослоев из двух разных сфероидов останавливалось на стыке их фронтов, наползания слоев друг на друга ни в одном случае не наблюдали.

    Таким образом, на четвертом этапе работы были определены качественные и количественные характеристики спрединга клеточных слоев вокруг адгезированных сфероидов. Средняя площадь слоя клеток, образуемого вокруг сфероидов, статистически достоверно увеличивалась в течение 1-й недели (р<0,05) и статистически достоверно не изменялась в течение последующих сроков 2D культивирования (р>0,05).

    При иммуноцитохимическом окрашивании было выявлено, что 3D сфероиды РПЭ (4-х, 7-и и 11-и суток культивирования) активно экспрессируют маркеры RPE-65 (высокоспецифичный маркер пигментного эпителия сетчатки), ZO-1 (белок запирающих межклеточных контактов) и цитокератин 8, 18 (белки промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток), и практически не экспрессируют мезенхимальный маркер виментин.