Рис. 21. Спрединг клеточного слоя вокруг сфероидов РПЭ на примере двух одиночных сфероидов. А. 24 часа культивирования. В. 3 суток культивирования. С. 7 суток культивирования. Эллипсами указаны группы клеток, имеющих близкую к гексагональной форму
Рис. 22. Неоднородность образуемого слоя клеток. 1 - ядро клеточного слоя (остаток сфероида), 2 – пояс многослойного эпителия, 3 – монослой клеток на периферии. А. 7 сутки 2D культивирования сфероида. В. 28 сутки 2D культивирования сфероида
Адгезия трансплантата и распространение (спрединг) вокруг него слоя клеток – две составляющие процесса приживления, первая из которых была изучена на третьем этапе работы.
На четвертом этапе работы изучали процесс спрединга слоя клеток РПЭ, образующегося вокруг адгезирующих к субстрату сфероидов. В соответствующих подразделах даны качественное и количественное описания наблюдаемых явлений.
3.4.1. Качественные феномены, наблюдаемые при реконструкции слоя ретинального пигментного эпителия in vitro
В первые сутки сфероиды прикреплялись к поверхности дна лунок культуральных планшетов и в течение последующих дней «распластывались», образуя вокруг изначальной зоны прикрепления слой клеток пигментного эпителия (рис. 21).
Рис. 23. Ув. х100. Вид слоя РПЭ на 28 сутки. Заметна полигональность депигментированных клеток
Рис. 24. Деградация клеточного слоя РПЭ. А. Клеточная культура на 28 день культивирования сфероидов в 2D условиях. В. 4 сутки после отмены питательной среды. С. 7 сутки после отмены питательной среды. D. 14 дней после отмены питательной среды. Клеточный сгусток отслоен, свободно флуктуирует в жидкости
По своей морфологии клетки образуемого периферического монослоя имели пониженное содержание пигмента, однако их форма была близка к гексагональной (рис. 21.С; рис. 23)
Слой клеток распространялся ограниченно, не достигая края лунки планшета, кроме случаев, когда сфероид смещался близко к краю случайным током жидкости. Распространение клеточных монослоев из двух разных сфероидов останавливалось на стыке их фронтов, наползания слоев друг на друга ни в одном случае не наблюдали.
Рис. 25. Измерение площади распространяющегося слоя клеток с помощью программного обеспечения CellSens Dimension (Olympus, Япония). А. Первые сутки 2D культивирования. В. Третьи сутки 2D культивирования
Рис. 26. Динамика изменения площади слоя клеток РПЭ вокруг сфероидов на поверхности субстрата
3.4.2. Изменение площади слоя ретинального пигментного эпителия in vitro Диставлены на рис. 25.
В Таблицах 30 и 31 представлены результаты измерения площади образуемого вокруг сфероидов клеточного слоя. Средняя площадь слоя клеток, образуемого вокруг как одиночного сфероида (Таблица 24), так и вокруг пары сфероидов (Таблица 25) статистически значимо изменялась в зависимости от времени культивирования (F критерий, P<0,05). Информация представлена графически на рис. 26.
Средняя площадь слоя клеток, образуемого вокруг как одиночного сфероида, так и вокруг пары сфероидов РПЭ статистически значимо изменялась в течение первой недели культивирования (P<0,05) и статистически незначимо в течение последующих недель (критерий Стьюдента, P>0,05).
Таблица 24 Изменение площади клеточного слоя вокруг сфероидов в 2D культуре (одиночный сфероид)
Таблица 25 Изменение площади клеточного слоя вокруг сфероидов в 2D культуре в различные сроки 2D культивирования (два сфероида)
Таким образом, на четвертом этапе работы были определены качественные и количественные характеристики спрединга клеточных слоев вокруг адгезирующих сфероидов.
Непосредственно вокруг сфероида образовывался пояс многослойного эпителия шириной 50-100 мкм, плавно переходящий в монослой полигональных депигментированных клеток; указанная неоднородность слоя эпителия сохранялась вплоть до отмены питательной среды на 28-е сутки 2D культивирования, после чего происходило постепенное сморщивание и отслоение эпителия; ни в одном случае не было отмечено распада отслоенной культуры на отдельные клетки.
Средняя площадь слоя клеток, образуемого вокруг сфероидов, статистически достоверно увеличивалась в течение первой недели (P<0,05) и статистически достоверно не изменялась в течение последующих сроков 2D культивирования, P>0,05.
