3.5. Исследование ультраструктуры, плотности и жизнеспособности эндотелиальных клеток донорских роговиц, консервированных в среде собственной рецептуры

     Целью данной части работы стало: провести морфометрические исследования стабильности, плотности и жизнеспособности эндотелиальных клеток донорских роговиц после консервации в разработанной среде.

    На данном этапе было сформировано 2 группы исследования: опытная и контрольная, при этом в опытной группе консервация осуществлялась в заявленной среде собственной рецептуры, в контрольной – в растворе для хранения донорской роговицы (ТУ № 9398-013-29039336-2008 (пропись среды Борзенка-Мороз).

    Для оценки состояния мембран клетки и ее органелл использовалась трансмиссионная электронная микроскопия на электронном микроскопе JEM 1200 EX II (Япония). Подсчет плотности эндотелиальных клеток проводился с помощью кератоанализатора для Глазных тканевых банков (модель 98, «Canon», Япония).

    Все роговицы подвергались гипотермической консервации при +4…6⁰С в течение 1х (n=6), 3х (n=6), 7ти (n=6) и 9ти (n=6) суток.

     При трансмиссионной микроскопии эндотелиальных клеток донорских роговиц разница между опытной и контрольной группами была отмечена уже на 1-е сутки эксперимента; в опытной группе наблюдалось уплотнение не только наружных клеточных, но и внутриклеточных мембран, с усилением эффекта на вторые сутки и сохранением его до 6-х суток консервации. В образцах опытной группы на 9-е сутки были обнаружены участки начального повреждения внутриклеточных, в частности митохондриальных мембран эндотелиальных клеток донорских роговиц (Рис. 10 (А-Б).

    При этом в контрольной группе наблюдалось постепенное истончение и повреждение клеточных мембран начиная с пятых суток, выявлены грубые ультраструктурные изменения с паринхиматозной дегенерацией, то есть осаждением клеточных белков в матриксе цитоплазмы эндотелиальной клетки роговицы, что является проявлением необратимых клеточных процессов. На Рисунке 10 (В-Г) представлена трансмиссионная электронная микроскопия эндотелиальной клетки роговицы образца из контрольной группы на 9е сутки консервирования.

    При оценке морфометрических характеристик выявлено, что за 9 суток консервации потеря плотности эндотелиальных клеток донорских роговиц в опытной группе составила - 2,7%, в контрольной группе – 5%. Процент потери эндотелиальных клеток отображен на Рисунке 11, Таблице 18.

     При анализе потери эндотелиальных клеток в связи с развитием апоптоза обнаружено, что количество поврежденных клеток увеличивалось постепенно (Рис. 12) и к 9 суткам консервации в опытной группе достигало - 2,5 %, в контрольной группе – 4,3 % (Рис. 13, Табл. 19).

    Таким образом, консервация донорских роговиц в среде предложенной рецептуры способствует сохранению ультраструктуры эндотелиальных клеток, методом трансмиссионной электронной микроскопии показало, что уже на 1-е сутки эксперимента в опытной группе наблюдалось уплотнение наружных клеточных и внутриклеточных мембран с усилением эффекта на вторые сутки и сохранением эффекта до 6-х суток консервации, а также оказывает противоапоптотическое действие, при анализе потери эндотелиальных клеток по причине апоптоза обнаружено, что количество поврежденных клеток увеличивалось постепенно и к 9 суткам консервации достигало всего 2,5 % (в контрольной группе 4,3 %).