3.5.Результаты изучения адгезивных свойств сфероидов ретинального пигментного эпителия в условиях органной культуры хороидально-пигментного комплекса

     На пятом этапе работы проводили испытание способности сфероидов, получаемых по разработанной технологии, к реконструкции слоя РПЭ в условиях органной культуры ХПК донора-трупа. Для этого на первом этапе модифицировали известный способ создания органной культуры ХПК донора-трупа. На втором этапе трансплантировали сфероиды, полученные по разработанной ранее методике на поверхность деэпителизированной мембраны Бруха в органной культуре ХПК.

    Этапы описаны в соответствующих подразделах раздела 3.5.1.

    3.5.1. Формирование органной культуры хороидально-пигментного комплекса донора-трупа в оригинальной модификации

    Ткань ХПК является крайне нежной и, свободно располагаясь в толще раствора может сгибаться, комкаться и сворачиваться в спираль от малейших воздействий, даже от неизбежного колыхания жидкости в посуде при ее перемещении и смене питательной среды. Манипуляции с незакрепленным фрагментом осуществимы только в толще жидкости, что не позволяет выставлять фрагмент на воздух без специального устройства даже кратковременно – фрагмент повисает бесформенной каплей (рис. 27).

    Известен способ выделения ткани ХПК вместе с подлежащей склеральной оболочкой в качестве опоры – используется естественное прикрепление хороидеи к склере при помощи вортикозных вен [279]. Однако, данный способ фиксации ХПК не обеспечивает должного уровня иммобилизации ткани – края лоскута по-прежнему подвержены свободной флуктуации. Альтернативным выходом является фиксация ХПК или его отдельных слоев в опорном устройстве. Будучи помещенным в зажим, фрагмент, оказывающийся в центре, не сминается, не комкается и не сворачивается при механических манипуляциях [294]. В данной работе был предложен вариант опорного устройства для фиксации фрагмента ХПК, выделенного по оригинальной методике.

     Глазное яблоко, соответствующее критериям, описанным в разделе 2.5.1., полностью погружали в стерильную чашку Петри (10 см), наполненную DMEM/F12, нагретым в инкубаторе до 37°С, в качестве иммерсионной среды.

    Склеру рассекали спереди назад двумя, тремя, или четырьмя меридиональными разрезами длиной ⅔ длины глазного яблока, параллельными переднезадней оси глаза через равные промежутки с получением двух, трех или четырех «лепестков» склеры. «Лепестки» склеры поочередно отгибали и со стороны супрахориоидального пространства пересекали вортикозные вены и внутрисклеральную часть зрительного нерва, после чего склеру удаляли из операционного поля. Далее наносили три разреза ХПК – первый круговой разрез – на расстоянии 1 мм от зубчатой линии, один меридиональный разрез – в любом меридиане в направлении от первого разреза спереди назад к культе диска зрительного нерва и второй круговой разрез на расстоянии 1 мм от культи зрительного нерва; далее ХПК аккуратно отделяли от нейральной сетчатки пинцетом, вырезали из нее фрагмент неправильной формы площадью около 2х2 ориентировочно в проекции макулярной области (заявка на патент РФ №2014152576; рис. 28).

    Каждый фрагмент помещали в кольцевой зажим-держалку клетками РПЭ вверх. Зажим представлял собой крышку-замок отрезанную от стандартной пробирки типа «Эппендорф» (рис. 29) и простерилизованную стандартным методом.

    Пробирка «Эппендорф» изготовлена из прозрачного полипропилена, химически инертного, нерастворимого и широко применяющегося для хранения и транспортировки биологических материалов.

    Фрагмент ХПК оказывался прочно закреплен по периферии, а центральная часть фрагмента - расправленной и подвешенной. Открытой к доступу оказывалась подвешенная круглая зона фрагмента размером около 1х1 см Фрагмент ткани образовывал собой дно «микроколодца», сформированного стенками зажима. Каждый зажатый фрагмент помещали в отдельную лунку культурального планшета (рис. 30).

    На поверхность фрагмента ХПК наливали 1 мл смеси 0,25% раствора трипсина и раствора Версена (1:1) и инкубировали в стандартных условиях.

     Спустя 15 минут инкубации под бинокулярным микроскопом (ув.х4) скарифицирующим движением шпателя-скребка производили локальную деэпителизацию в центральной области фрагмента площадью около 1 см² .

    Поверхность фрагмента промывали от клеток РПЭ и ферментативной смеси стерильным фосфатно-солевым буфером (pH 7,4) и заливали 2 мл питательной среды (заявка на патент РФ №2014152574).

    На деэпителизированную поверхность переносили сфероиды РПЭ, сконструированные как указано в разд. 2.5.2, по одному сфероиду от каждого донора РПЭ на поверхность одного фрагмента ХПК, заливали 2 мл питательной среды и инкубировали в стандартных условиях. Замену среды проводили ежедневно.

    Наличие адгезии определяли аналогично тому как описано в разд. 2.3. -по прекращению их свободной флуктуации в растворе при действии низкочастотных механических колебаний (проводили тест с легкой перкуссией столешницы, на которой установлен инвертированный микроскоп), а также по появлению первых признаков распластывания (спрединга) клеточного слоя вокруг сфероида.

    В качестве контроля сфероиды РПЭ, сконструированные аналогично опытной группе (99 сфероидов «гладкой» морфологии на 7 сутки 3D культивирования со средним диаметром 203,0±26,5 мкм), переносили на внутреннюю поверхность фрагмента склеральной оболочки размером 2х2 см, с зачищенной бурой пластинкой по одному сфероиду на один фрагмент склеры. Склеральные фрагменты извлекались из глазных яблок, отобранных в качестве источников ХПК.

    3.5.2. Результаты сокультивирования сфероидов ретинального пигментного эпителия в органной культуре хороидально-пигментного комплекса

    На рис. 31 представлена исходная картина расположения сфероидов РПЭ сразу после их трансплантации на поверхность мембраны Бруха экспланта ХПК. Рис. 31.А - виден край зажима-держалки, вдоль которого располагается полоса неудаленного нативного РПЭ. Рядом – группа сфероидов. Рис. 31.В – при большем увеличении видны 11 сфероидов с четкими очертаниями. На рис. 32.А. показан сфероид РПЭ под большим увеличением на фоне мембраны Бруха с редкими остаточными клетками нативного РПЭ. При легкой перкуссии столешницы под микроскопом наблюдалась флуктуация сфероидов – они оказывались не прикреплены.

    Уже спустя 24 часа культивирования выявляли прикрепление сфероидов методом перкуссии. На третьи сутки органного культивирования отмечали начало распространения клеточного слоя вокруг сфероидов (рис. 33). На рис. 33. видны те же 11 сфероидов РПЭ, что и на рис. 28, но уже с размытыми контурами – вокруг них появляется слой клеток. Сфероиды расположены в тех же позициях, что и в день трансплантации. При перкуссии столешницы флуктуации не происходит – сфероиды адгезировали к поверхности мембраны Бруха. На рис. 32.В. представлен тот же одиночный сфероид, что и на рис. 32.А – он адгезировал к субстрату, в центре видно сгущение клеток и распространяющийся слой клеток РПЭ вокруг. Клетки, исходящие из сфероида, отличаются от клеток нативного РПЭ отсутствием пигментации, однако имеют сопоставимые с ними размеры и форму.

     Всего из 99 трансплантированных сфероидов адгезии подверглись 71 (71,7%). 20 сфероидов не прикрепились (20,2%) и 8 сфероидов не были обнаружены после трансплантации (8,1%).

    Неприкрепившиеся на третий день органного культивирования сфероиды были либо покрыты остатками неотмытых клеток нативного РПЭ (рис. 34), либо прикрепились к разволокнениям мембраны Бруха, образовавшимся вследствие неаккуратной ее деэпителизации.

    Поскольку предложенная пластиковая держалка не пригодна к нарезке на гистологическом микротоме, на 3 сутки культивирования фрагмент ХПК извлекали из держалки путем раскрытия ее замка и помещали на внутреннюю поверхность фрагмента склеральной оболочки, извлеченного из того же донорского глаза (Рис. 35) и исследовали по стандартной методике (см. разд. 2.5.3)

    Морфологическое исследование на 3 сутки органного культивирования подтвердило факт адгезии сфероидов (рис. 36). Между двумя слоями склеральной оболочки находилась фиксированная собственно сосудистая оболочка, к мембране Бруха которой прикрепен сфероид с пигментированными клетками внутри.

    В контрольной группе ни один сфероид РПЭ не прикрепился к склеральной оболочке в течение 7 суток наблюдения.

    Таким образом, на пятом этапе работы была продемонстрирована способность сфероидов РПЭ адгезировать к поверхности деэпителизированной мембраны Бруха и образовывать вокруг себя слой клеток РПЭ. Демонстрация была произведена в условиях органной культуры ХПК донора-трупа в течение 3 суток. Результаты подтверждены методами световой микроскопии и гистологического исследования.

    В Главе 3 были описаны пять этапов работы, проведенных в соответствии с пятью поставленными задачами.

     В разделе 3.1 была разработана оригинальная методика выделения клеток РПЭ из глаз доноров-трупов для трансплантации; был показан более высокий уровень чистоты получаемой суспензии клеток РПЭ по сравнению с суспензией, получаемой по методике, известной ранее, при их статистически достоверно сопоставимой жизнеспособности.

    Полученные клетки РПЭ были использованы для разработки способа получения сфероидов РПЭ с различными качественными и количественными параметрами (радел 3.2). Получаемые сфероиды различались по характеру поверхности – одна часть сфероидов обладала «гладкой» поверхностью, другая – «бахромчатой». Первые – имели тенденцию к уменьшению в диаметре в течение первой недели 3D культивирования и в ряде случаев изменяли характер поверхности, покрываясь «бахромой» клеточного дебриса; вторые – имели «бахромчатую» поверхность и в процессе культивирования не изменялись ни в диаметре, ни по характеру поверхности. При сравнении диаметров получаемых сфероидов с внутренним диаметром витреоретинальных инструментов, было установлено, что для удовлетворения требованиям современной витреоретинальной хирургии для трансплантации инструментами диаметра 25-27 Gauge пригодными могут являться сфероиды, полученные при посевных количествах 500-1000 клеток на одну висячую каплю.

    На третьем этапе работы (раздел 3.3) были разработаны критерии трансплантабельности получаемых по разработанной методике сфероидов.

    Трансплантабельность изучали по параметрам жизнеспособности клеток, составляющих сфероиды, и по способности сфероидов адгезировать к поверхности стандартного субстрата (полистирол культуральной посуды). Было показано, что наивысшими показателями трансплантабельности обладали сфероиды, полученные при посевных количествах 500-5000 клеток РПЭ на одну висячую каплю, культивированные в трехмерных условиях в течение 7-14 суток и обладающие «гладкой» поверхностью.

    Сфероиды, подготовленные из клеток РПЭ, выделенных по методике, разработанной в разделе 3.1, по технологии, описанной в разделе 3.2, и отобранные по параметрам наивысшей трансплантабельности (раздел 3.3), были исследованы на предмет способности образовывать слой клеток РПЭ на поверхности стандартного субстрата (раздел 3.4). Установлено, что при помещении сфероидов РПЭ на поверхность субстрата вокруг них образовывался слой клеток РПЭ с переменной слойностью: остаток трансплантированного сфероида оставался заметен вплоть до 28 дня 2D культивирования сфероидов; непосредственно вокруг него обнаруживали пояс многоклеточного эпителия шириной 50-100 мкм, постепенно переходящий в клеточный монослой. Слой клеток распространялся наиболее быстро в первые 7 суток культивирования, выходя затем в фазу плато и затормаживаясь, не достигая края культуральной посуды.

    На пятом этапе проводили испытание сфероидов с наивысшей трансплантабельностью на предмет адгезивности в условиях органной культуры ХПК донора-трупа. Для этого был модифицирован известный способ получения органной культуры ХПК, после чего на поверхность деэпителизированной мембраны Бруха образцов ХПК переносили сфероиды РПЭ с параметрами наивысшей трансплантабельности и культивировали в течение 3 суток. Факт адгезии трансплантированных сфероидов устанавливали на первые сутки, а к третьим суткам наблюдали распространение слоя клеток РПЭ вокруг сфероидов. Часть сфероидов не адгезировала к поверхности деэпителизированной мембраны Бруха образцов ХПК, прикрепляясь к разволокнениям мембраны Бруха и/или частично покрываясь оставшимися после деэпителизации мембраны Бруха клетками РПЭ реципиентной ткани.