3.5 Результаты изучения влияния кросслинкинга на химическую устойчивость донорской роговицы к протеолитическим ферментам методом электронной микроскопии

     Протеолитические ферменты слезы могут проявлять свои агрессивные свойства в послеоперационном периоде и оказывать негативное влияние на эпителизацию и приживление донорского трансплантата. Усиление биохимической устойчивости роговичной ткани к воздействию агрессивных факторов является важным фактором снижения количества расплавлений трансплантата. На примере коллагеназы была создана модель протеолитических ферментов in vitro. Задачей данного исследования стало изучение химической устойчивости кросслинкинг модифицированной донорской роговицы к протеолитическим ферментам методом сканирующей электронной микроскопии.

    По результатам СЭМ следует, что строма роговиц 1-ой контрольной группы была представлена пластинами строго ориентированных волокон белка коллагена (рисунок 9а). В строме роговиц 2-ой группы отмечались утолщение коллагеновых фибрилл, уменьшение расстояния между пластинами коллагена, более компактная укладка пластин под воздействием рибофлавина и ультрафиолета по сравнению с контрольной группой (рисунок 9б).

    Роговицы 3-ей группы после воздействия коллагеназы через 24 часа также сравнивались с контрольной группой: отмечалось разрушение коллагеновых фибрилл, нарушение продольной направленности пластин коллагена, нарушение структуры белка, визуализировались оставшиеся коагулированные части белковой фракции (рисунок 10а). Через 24 часа фибриллы коллагена роговиц 4-ой группы, обработанные рибофлавином, ультрафиолетом и коллагеназой, сохраняли свою структуру и направленность, прослеживалась более компактная укладка пластин коллагена по сравнению с роговицами из 3-ей группы (рисунок 10б).

     Динамическая оценка действия коллагеназы в 3-ей и 4-ой группах через 72 часа показала, что в 3-ей группе наблюдалось отчетливое разрушение коллагена стромы, отсутствие какой-либо направленности волокон, визуализировались оптические пустоты в зонах разрушенного коллагена (рисунок 11а), в то время как в 4-ой группе воздействие коллагеназы было минимальным с сохранением структуры и направленности пластов коллагена (рисунок 11б).

    При анализе изображений СЭМ подтвержден факт «склеивания» фибрилл и утолщения коллагеновых волокон в роговице под воздействием рибофлавина и ультрафиолетового излучения, более плотная упаковка пластин коллагена, уменьшение щелевых пространств между пластинами. Такая архитектоника приводила к усилению биохимической устойчивости ткани. При воздействии коллагеназы терялась четкая направленность волокон, а через некоторое время происходило разрушение структуры белка коллагена, что отчетливо было видно при воздействии коллагеназы на нативную роговицу через 24 и особенно через 72 часа. После обработки донорской роговицы по методу кросслинкинг воздействие коллагеназы становилось не столь разрушительным, сохранялась поперечная направленность пластин коллагена без признаков разрушения, с более компактной упаковкой и минимальными межщелевыми пространствами.

    Таким образом, созданная модель протеолитических ферментов на основе коллагеназы продемонстрировала большую ферментативную устойчивость кросслинкинг подготовленной роговицы с сохранением поперечной направленности и более компактной упаковкой пластин коллагена.