4.1. Методы молекулярно-генетических исследований

     Всего было исследовано 78 образцов замороженной цельной крови с антикоагулянтом в объеме 4-6 мл. Из которых 11 мужчин и 67 женщин. Образцы были обезличены.

    4.1.1. Выделение ДНК из образцов крови

    ДНК была выделена из размороженных образцов крови (400 мкл) с помощью набора Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega Corp., США) согласно протоколу производителя.

    4.1.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

    Праймеры к интересующим участкам ДНК были подобраны и проверены на специфичность с помощью программ «Premier Primer» («Premier Biosoft», США) и Primer-BLAST («NCBI», США). Последовательности праймеров приведены в табл. 4. Олигонуклеотиды для проведения ПЦР были синтезированы в НПФ «Литех» (Россия). Для фрагментного анализа числа тринуклеотидных повторов использовался праймер CTG-2F с флуоресцентным красителем FAM. Для проведения ПЦР использовался стандартный набор для амплификации ДНК «Gene Pak® PCR MasterMix Core» («IsoGene Lab. Ltd.», Россия). Объем реакции 20 мкл, количество ДНК в реакцию – 30 нг, конечная концентрация праймеров 0,3мкМ. Учёт результатов ПЦР проводили методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. В качестве маркера молекулярного веса ДНК использовался «O’Gene Ruler DNA Ladder Mix» («Thermo Fisher Scientific», США).

    4.1.3 Секвенирование по Сэнгеру ПЦР-продуктов

    Очистка реакционной смеси осуществлялась ферментным методом. Реакцию секвенирования проводили с использованием набора BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit («Thermo Fisher Scientific», США) по протоколу производителя. Секвенирование проводили на капиллярных секвенаторах ABI Prism 3730XL («Applied Biosystems», США). Результаты секвенирования анализировали в программе Unipro UGENE.

    Для учета результатов ПЦР с праймерами к маркеру тринуклеотидных повторов (CTG) на основании маркера молекулярного веса ДНК в программе «Adobe Photoshop CS5» проводилась отсечка на уровне 350 п.н. Эта длина соответствует ампликону, содержащему 39 повторов CTG. Образцы, в которых была четкая или размытая полоса в диапазоне длин выше уровня отсечки считались несущими хотя бы одну экспансированную аллель CTG18.1. Если в этих образцах присутствовала также полоса в диапазоне длин ниже уровня отсечки, то такие образцы считались моноаллельными по экспансированным повторам CTG18.1. Если полоса в диапазоне длин ниже уровня отсечки отсутствовала, то такие образцы расценивались как биалельные по экспансированным повторам CTG18.1.