5.1. Морфофункциональные изменения роговицы кролика после имплантации полимерных опорных пластин кератопротеза

     Целью данной части работы явилось изучение биосовместимости разработанных моделей опорных пластин кератопротеза в эксперименте in vivo после имплантации в роговицу экспериментальных животных (кролики).





    Для достижения цели исследования были поставлены и решены следующие задачи: оценить биосовместимость ОПК клиническими методами исследования: биомикроскопия и оптическая когерентная томография, в динамике послеоперационного периода, а также при помощи световой и сканирующей электронной микроскопии.





     5.1.1. Результаты исследования роговицы кролика методом биомикроскопии





    Экспериментально-морфологическое исследование in vivo включало 15 животных, которых после хирургического вмешательства наблюдали в течение 90 суток, далее всех животных выводили из эксперимента для проведения морфологических исследований. В соответствии с дизайном исследуемых ОПК, были сформированы 3 группы исследования. Первую составили 5 кроликов (5 глаз), в роговицу которых имплантировали ОПК из гидрофобного акрила со сквозными квадратными отверстиями размерами 200х200 мкм (модель №1). Во вторую группу вошли 5 кроликов (5 глаз), в роговицу которых имплантировали ОПК из гидрофобного акрила со сквозными отверстиями трапециевидной формы и изменяющейся величины от периферии к центру с размерами ячеек от 170х130 мкм до 180х70 мкм (модель №2). Животным контрольной группы имплантировали ½ части ОПК модели Федорова-Зуева, выполненную из титана.





     При биомикроскопии у всех кроликов опытных групп в ранние сроки наблюдения (первые 3 суток) визуализировали наличие незначительного отека роговицы в области операционного шва (рисунок 23). Умеренная поверхностная инъекция сосудов конъюнктивы, расценивалась как ответная реакция ткани на хирургическую травму. Она постепенно исчезала к 14-м суткам после операции (таблица 4).





    Осложнение послеоперационного периода наблюдали у 1 экспериментального животного (1 глаз) из 1-ой группы на 30-е сутки. При биомикроскопии роговицы над зоной ОПК определяли локальное стромальное помутнение с последующей протрузией ОПК (рисунок 24). Во второй группе у 1-ого кролика (1 глаз) наблюдали осложнение послеоперационного периода на 30-е и 90-е сутки. При биомикроскопии роговицы над зоной ОПК не имеющей ячеистой структуры определяли небольшую зону стромального помутнения, с последующей десквамацией эпителия, истончением слоев роговицы и формированием язвенного дефекта (рисунок 25).





    Также в группе 2 (1 глаз) при биомикроскопии наблюдали помутнение передних слоев роговицы над ОПК на сроке 90 суток (рисунок 26). В остальных случаях в опытных группах визуализировали роговицу без признаков воспалительной реакции, ОПК сохраняли правильное положение в роговичном кармане. В контрольной группе положение ОПК модели Федорова-Зуева в интрастромальном кармане было стабильным во всех случаях. При этом окружающая роговица сохраняла прозрачность, видимых дефектов передних отделах стромы не наблюдали (рисунок 27).





     5.1.2. Результаты исследования роговицы кролика методом оптической когерентной томографии





    При выполнении оптической когерентной томографии (Optovue, США) определяли толщину роговицы над центральной областью ОПК (таблица 5).





    По данным полученных результатов между 3-мя группами существуют статистически значимые различия по уровню исследуемого признака. В первой группе в проекции интрастромального кармана визуализировали ОПК, равномерно располагающийся в средних слоях стромы роговицы (на 4-х глазах из 5) (рисунок 28).





     При этом в 1-ой группе (1 глаз) на 30-е сутки зарегистрировали выпячивание ОПК в направлении переднего эпителия с истончением надлежащих слоев стромы роговицы до 101 мкм с последующей протрузией ОПК (рисунок 29).





    Во второй группе в проекции интрастромального кармана визуализировали ОПК модели №2, равномерно располагающиеся в средних слоях стромы роговицы (на 3-х глазах из 5) (рисунок 30).





    У 1-ого кролика (1 глаз) второй группы определяли язвенный дефект с истончением слоев роговицы до 44 мкм над центральной областью ОПК на 30-е сутки послеоперационного периода (рисунок 31).





     У 1-го кролика (1 глаз) второй группы на 90-е сутки наблюдали зону стромального помутнения над поверхностью ОПК с истончением роговицы до 58 мкм (рисунок 32).





    При этом в контрольной группе во всех случаях на 30-е и 90-е сутки визуализировали ОПК в проекции интрастромального кармана, равномерно располагающиеся в средних слоях стромы роговицы (рисунок 33).





    Согласно результатам оптической когерентной томографии, в 1- ой группе был выявлен 1 случай протрузии ОПК модели №1, что было обусловлено имплантацией ОПК в поверхностные слои стромы роговицы кролика на глубину менее 150 мкм. При этом во второй группе наблюдали истончение роговицы над центральной областью ОПК, что вероятнее всего было связано с разобщением слоев роговицы в зоне без ячеистой структуры и планомерным уменьшением размера ячеек ОПК модели №2.





     5.1.3. Результаты гистологического исследования роговицы кролика методом световой микроскопии





    По окончании экспериментального исследования на сроке 90 суток при проведении световой микроскопии в группах 1 (4 глаза) и группе 2 (5 глаз) визуализировали полости в строме центральных отделов повторяющие ячеистую форму протеза (рисунок 34).





     В обеих группах в строме передних отделов отмечали умеренный отек, в задних отделах признаков патологических изменений не выявлено. Во второй группе роговица была эпителизирована не полностью во всех случаях, наблюдали последовательное истончение эпителия от периферии к центру, в центральных отделах эпителий отсутствовал (таблица 6). При этом в группе 1 визуализировали полость в строме с фрагментами капсулообразования, в группе 2 элементы капсулы в полости отсутствовали (рисунок 35).





    В контрольной группе (5 глаз) в зоне сформированного роговичного кармана определяли центральный отдел стромы с фрагментами фиброзного капсулообразования и незначительным наличием клеточных компонентов по периферии, поверхность роговицы была полностью эпителизирована (рисунок 36).





    5.1.4. Результаты исследования роговицы кролика методом сканирующей электронной микроскопии





    В процессе проведения сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) оценивали ультраструктуру стромального «ложа» и «крышки» роговицы: наличие и ориентацию коллагеновых волокон. Данные параметры косвенно свидетельствуют об активации процесса неоколлагеногенеза и формировании капсулы, вокруг имплантированной ОПК. Сканирующую электронную микроскопию ОПК проводили с целью оценки степени взаимодействия клеток и стромальных структур роговицы с выбранными полимерными моделями.





     При выполнении исследования оценивали наличие на изучаемых поверхностях клеток, волокнистых соединительнотканных элементов, степень деформации ОПК, сравнивали изображения в опытных и контрольных группах. Согласно результатам электронно-микроскопических исследований, в ячейках полимерных пластин и на их поверхности в обеих опытных группах было обнаружено незначительное количество клеточных элементов. В опытных группах отмечали образование капсулы из новообразованных волокон, при этом в 1-ой группе более выражено как вокруг ОПК, так и в ячейках (рисунок 37,38).







     В контрольной группе поверхность титанового опорного элемента была шероховатой, с участками неровных, острых краев и отсутствием клеточных элементов и молодых коллагеновых фибрилл (рисунок 39).







    В опытных группах на поверхности роговичного «ложа» определяли комплементарно сформированные ячеистые структуры ОПК с наличием незначительных скоплений клеток и коллагеновых волокон (рисунок 40, 41).







    В опытных группах на поверхности роговичной «крышки» визуализировали подобные структуры с коллагеновыми волокнами различного диаметра и в меньшем количестве, по сравнению с поверхностью «ложа» (рисунок 42, 43).







    Согласно результатам электронно-микроскопических исследований, в ячейках полимерных пластин и на их поверхности обнаружены адгезированные волокнистые элементы, которые в опытных группах образовывали участки капсулообразования, при этом более выражено на поверхности и в ячейках ОПК модели №1, что совпадало с данными световой микроскопии. В контрольной группе были обнаружены минимальные адгезивные свойства титановой пластины к соединительнотканному остову стромы роговицы без наличия клеточных элементов и молодых волокон. Представленная картина, по всей вероятности, обусловлена биоинертными свойствами титана.







     Наличие волокнистых структур на внутренней поверхности ложа в большем количестве, чем на поверхности «крышки», вероятнее всего обусловлено механическим повреждением внутренней поверхности роговицы в процессе имплантации ОПК (альтерации) как первой фазы воспалительного процесса с последующим формированием капсулообразования. Также не исключены различия пролиферативного ответа характерного для поверхностных и глубоких слоёв роговицы в результате различия клеточного состава и условий питания этих слоёв.







     Таким образом, проведенные клинические исследования показали, что при максимальном сроке наблюдения (до 90 суток) в первой группе был отмечен 1 случай протрузии ОПК модели №1 обусловленный поверхностной имплантации в роговицу кролика, во второй группе у 2-х кроликов наблюдали истончение слоев роговицы над центральной частью ОПК модели №2. По данным световой микроскопии, установлено, что пребывание в роговице кролика исследуемых ОПК 1-ой опытной группы в изученные сроки вызывало образование грубой волокнистой соединительной ткани. В опытной группе №1, по данным сканирующей электронной микроскопии, в ячейках полимерной пластины и на ее поверхности обнаружены адгезированные волокнистые элементы, при этом в контрольной группе на поверхности титановой пластины клеточные элементы отсутствовали. Ввиду этого, опорная пластина с отверстиями 200х200 мкм (группа №1) перспективна для использования в качестве основы конструкции новой модели кератопротеза.