5.4. Оценка генетических факторов прогноза в ретроспективной группе пациентов с увеальной меланомой

     Оценку генетических факторов прогноза осуществляли согласно мутационной и цитогенетической классификациям, о которых было сказано в главе «Обзор литературы».

    Мутационный анализ проводили по двум направлениям – анализ мутаций-«драйверов» и анализ мутаций-«модификаторов». Изучение «драйверов» включало анализ мутаций, являющихся триггерными для развития УМ, - мутаций в «горячих точках» генов GNA11 и GNAQ. Оценивали частоту встречаемости данных молекулярных нарушений, возможность применения тестирования на эти мутации в дифференциальной диагностике УМ, а также их возможное влияние на вероятность развития МТС.

    Среди характерных для УМ «модификаторных» нарушений исследовали мутации в «горячих точках» генов EIF1AX (экзоны 1 и 2), SF3B1 (экзон 14) и SRSF2 (экзон 1), а также инактивацию белка BAP1 и мутацию гена ВАР1. Оценивали их встречаемость в группах пациентов с МТС и без МТС, а также их возможное влияние на вероятность развития МТС. На основании полученных результатов определяли молекулярный прогностический класс каждого исследованного образца в соответствии с мутационной классификацией.

    Цитогенетический анализ включал анализ всех описанных при УМ (см.главу Обзор литературы) хромосомных аберраций-«модификаторов», а именно нарушений копийности регионов 1р, 3р и 3q, 6p и 6q, 8p и 8q. Кроме того, для 3р осуществляли дополнительный анализ маркерного региона. Для определения статуса 3р оценивали статус копийности гена ВАР1. Проводили анализ частоты описанных нарушений и оценивали их потенциальную прогностическую значимость. На основании полученных результатов определяли молекулярный прогностический класс каждого исследованного образца в соответствии с мутационной классификацией.

     По итогам выполненного анализа проводили сопоставление цитогенетической классификации с мутационной и определяли потенциальную клиническую полезность каждой из них.

    5.4.1. Мутационный профиль

    Мутации в генах GNAQ и GNA11

    Молекулярная верификация диагноза УМ путем тестирования на драйверные мутации дала положительный результат в 89 образцах из 96 (чувствительность – 93%). При этом в 40 случаях выявлены мутации в гене GNA11. На первом этапе анализа мутация c.626A>T, p.(Gln209Leu) в экзоне 5 гена GNA11 определена в 39 образцах из 40. На втором этапе в экзоне 4 гена GNA11 в ДНК одного образца обнаружена редкая мутация c.547C>T, p.(Arg183Cys).

    В 49 образцах УМ выявлены нарушения в гене GNAQ. Мутации c.626A>T, p.(Gln209Leu) и c.626A>C, p.(Gln209Pro) в экзоне 5 гена GNAQ обнаружены в 13 и 33 образцах, соответственно. Еще в одном образце определена редкая мутация c.627A>T, p.(Gln209His). В процессе поиска нарушений в экзоне 4 гена GNAQ в 2 образцах выявлена мутация c.548G>A, p.(Arg183Gln).

    Процентное соотношение выявленных мутаций в каждом из генов – GNA11 и GNAQ – представлено на рис.5.6.

     Кроме того, оценивали встречаемость различных нарушений в генах GNA11 и GNAQ в группах пациентов с МТС и без МТС (таблица 5.4).

    Оценка выживаемости при мутациях экзонов 5 генов GNA11 и GNAQ.

    Несмотря на имеющиеся данные об отсутствии прогностического значения «драйверных» мутаций [44, 133, 169], выявленные нарушения оценивали с точки зрения влияния на развитие МТС. При этом проводили анализ только мутаций в экзоне 5 генов GNA11 и GNAQ. Экзон 4 обоих генов с точки зрения прогноза не исследовали ввиду их редкой встречаемости и малой выборки пациентов с подобными нарушениями (n=3 (3%) от общего числа драйверных мутаций). Требуется дальнейший набор ретроспективного материала прослеженных пациентов с УМ с такими нарушениями.

    GNA11

    При проведении сравнительного анализ общей выживаемости пациентов с УМ в зависимости от наличия мутации в экзоне 5 гена GNA11 по методу Каплана-Майера, было отмечено, что при сроке до 24 месяцев включительно вне зависимости от наличия или отсутствия мутации c.626A>T, p.(Gln209Leu) общая выживаемость не имела существенных различий (рис.5.7). Так, 2- летняя выживаемость пациентов без мутации в экзоне 5 гена GNA11 составила 70%, у пациентов с мутацией c.626A>T, p.(Gln209Leu) - 69% (р=0,03). По прошествии периода в 24 месяца после установленного диагноза УМ отмечается резкий спад выживаемости пациентов с мутацией c.626A>T, p.(Gln209Leu) в экзоне 5 гена GNA11 УМ по сравнению с пациентами, не имеющими такого нарушения: 3-летняя выживаемость составляет 49% для пациентов с мутацией, для пациентов без мутации - 63%; 5-летняя выживаемость для пациентов с мутацией и без – 34% и 54%, соответственно.

    Полученные статистически достоверные данные (р=0,03) свидетельствуют о повышении уровня развития МТС у пациентов, УМ которых имеет мутацию c.626A>T, p.(Gln209Leu) в экзоне 5 гена GNA11, при сроке наблюдения свыше 2 лет.

    GNAQ

    Сравнительная оценка развития МТС у пациентов в зависимости от наиболее часто встречающихся мутаций в экзоне 5 гена GNAQ (c.626A>C, p.(Gln209Pro) и c.626A>T, p.(Gln209Leu)), проведенная по методу Каплана-Майера, показала отсутствие статистически значимых различий (р=0,17). Трехлетняя выживаемость без мутаций в 5 экзоне гена GNAQ составила 50%, с мутацией c.626A>C, p.(Gln209Pro) – 61%, с мутацией c.626A>T, p.(Gln209Leu) – 77%. Пятилетняя выживаемость для тех же показателей отмечена на уровне 37%, 53% и 58% (рис. 5.8). Уровень выживаемость при редкой мутации c.627A>T, p.(Gln209His) не анализировали, т.к. данное нарушение было выявлено в ДНК опухоли лишь одного пациента.

     Молекулярно-генетическая верификация диагноза УМ путем анализа «драйверных» мутаций генов GNA11 и GNAQ обладает крайне высокой чувствительностью (93%) и может быть использована как дополнительный метод дифференциальной диагностики, в частности, при неоднозначной морфологической картине или при небольшом количестве материала, что имеет особое значение при проведении диагностической ТИАБ при подозрении на УМ.

    При этом необходимо оценивать как наличие часто встречающихся мутаций, так и редких, определяемых, по нашим данным, в 4% случаев. Показано, что выявление в экзоне 5 гена GNA11 мутации c.626A>T, p.(Gln209Leu), может свидетельствовать о некотором повышении риска развития МТС у пациентов с УМ при сроках наблюдения свыше 2 лет.

    Мутации генов EIF1AX, SF3B1 и SRSF2

    На первом этапе исследования нарушений, по данным литературы, влияющих на развитие МТС, оценивали мутации в «горячих точках» гена EIF1AX. Всего мутация гена EIF1AX выявлена в ДНК 17 (18%) образцов УМ из 96: 7 - в экзоне 1, 10 – в экзоне 2. При этом в группе пациентов с МТС нарушение выявлено лишь в одном опухолевом образце (мутация c.37C>T, p.(Arg13Cys) в экзоне 2), тогда как остальные 16 образцов, в ДНК которых определяли мутацию в «горячих точках» гена EIF1AX, были из группы пациентов без МТС со сроком наблюдения свыше 3 лет.

     Мутации в экзоне 14 гена SF3B1 выявлены в ДНК 8 (8%) образцов из 96.

    Среди них в трех образцах имела место мутация c.1874G>A, p.(Arg625His), в двух образцах - c.1873C>T, p.(Arg625Cys), еще в двух образцах - c.1873C>A, p.(Arg625Ser) и в одном – мутация c.1876A>T, p.(Asn626Tyr). При этом в группе пациентов с МТС было 5 образцов с нарушениями в экзоне 14 гена SF3B1, а в группе пациентов без МТС – 3. При этом в группе пациентов с МТС ни в одном случае из 5 не отмечено поражения легочной ткани (данные параметр оценивали ввиду имеющихся литературных данных (см.обзор).

    По результатам исследования мутаций в «горячих точках» гена SRSF2 (экзон

    1) методом ПЦР с последующим секвенированием продуктов ПЦР по Сэнгеру нарушений в ДНК не выявлено ни в одном из 96 образцов.

     Отмечено, что ни в одном образце не выявлено одновременного сочетания мутаций в «горячих точках» генов EIF1AX и SF3B1.

    Сводные количественные данные по всем мутациям «модификаторам» и их распределение по группам пациентов с МТС и без МТС приведены в таблице 5.5.

    Мутации «модификаторы». Оценка потенциального влияния на выживаемость

    По результатам выявленных нарушений оценивали также их влияние на развитие МТС при УМ. При этом мутации в «горячих точках» гена EIF1AX (экзон 1 и 2), учитывая их полиморфизм, объединяли для оценки выживаемости. Проведенный по методу Каплана-Майера анализ выживаемости показал, что пациенты с УМ с мутацией гена EIF1AX, имеют статистически достоверно более высокие (р<0,0001) значения как трехлетней, так и пятилетней выживаемости. Так, трех- и пятилетняя выживаемость пациентов с мутацией определена на уровне 94%, тогда как 3-летняя и 5-летняя выживаемость для пациентов без мутации составила 49% и 35% (рис. 5.9).

     Проведение сравнительного анализа выживаемости пациентов с УМ с мутацией в экзоне 14 гена SF3B1 и без нее не выявило достоверных различий (р=0,8) (рисунок 5.10)

    Проведенный анализ каждого из выявляемых нарушений, определяемых методом ПЦР с последующим секвенированием продуктов ПЦР по Сэнгеру показал, что мутации в гене EIF1АХ (экзоны 1 и 2) выявляли в 18% случаев, при этом основная доля нарушений приходилась на УМ пациентов, не имеющих МТС при сроках наблюдения свыше 3 лет. Несмотря на относительно невысокую встречаемость данной мутации, ее выявление в опухолевой ДНК сопряжено с достоверно более высоким уровнем выживаемости. Мутация в экзоне 14 гена SF3B1, отмеченная в 8% случаев, как показал статистический анализ, не влияет на выживаемость пациентов с УМ.

    Копийность гена ВАР1 и уровень экспрессии белка ВАР1

    Последним среди нарушений-«модификаторов» в рамках мутационной классификации риска развития УМ (см.главу «Обзор литературы») оценивали изменения ВАР1. При этом анализ проводили как иммуногистохимическим методом, оценивая уровень экспрессии белка ВАР1, так и методом MLPA, при котором определяли статус копийности гена ВАР1, расположенного на коротком плече хромосомы 3.

    Иммуногистохимический анализ уровня экспрессии белка ВАР1

     По результатам иммуногистохимического исследования 96 образцов ткани УМ, высокий уровень экспрессии выявлен в 42 образцах, средний – в 15, низкий – в 8. Еще в 31 образце экспрессия белка ВАР1 не выявлена вовсе.

    Результаты иммуногистохимического анализа уровня экспрессии белка ВАР1 в процентном соотношении представлены на рис.5.11.

    Далее анализировали выживаемость по каждому из типов экспрессии. При этом никаких статистически значимых различий или тенденции к их формированию отмечено не было (р=0,98) (рис.5.12).

    Определение количества копий гена ВАР1 методом MLPA

     По результатам исследования ДНК 96 образцов УМ на количество копий гена ВАР1 в 32 образцах была выявлена гетерозиготная делеция данного гена и еще в 18 образцах - его субклональная делеция. Амплификация гена ВАР1 была выявлена в 4 случаях, субклональная амплификация – в 11. В 31 образце не было выявлено никаких нарушений копийности гена ВАР1. Распределение в процентном соотношении полученных результатов среди всех образцов представлено на рис.5.13.

    Также оценивали распределение встречающихся изменений в гене ВАР1 по группам пациентов с МТС и без МТС (табл.5.7).

    Отмечали достоверное (р=0,006) преобладание делеции и субклональной делеции гена ВАР1 у пациентов с МТС УМ, а нормы, амплификации и субклональной амплификации – у пациентов без МТС. Для последующего анализа крайние значения – делецию и субклональную делецию, а также амплификацию и субклональную амплификацию – объединяли в более общие группы (делеция/амплификация). Основанием для этого стали близость понятий и единый принцип нарушений в гене ВАР1, а также отсутствие статистически достоверной разницы в выживаемости пациентов как с делецией и субклональной делецией (р=0,9) (рис.5.14, А), так и с амплификацией и субклональной амплификацией (р=0,7) (рис.1.14, В).

    Таким образом, среди 96 образцов УМ в 50 определяли делецию гена ВАР1, в 16 – амплификацию, а в оставшихся 31 образцах не было обнаружено значимых изменений количества копий гена BAP1. Было отмечено, что в большей половине образцов присутствует делеция гена ВАР1 (рис.5.15), другую половину составляют образцы без изменений или с амплификацией гена ВАР1.

     Интересным выглядело распределение полученных после объединения результатов по группам пациентов с МТС и без МТС (табл.5.8).

    Отмечено, что в группе пациентов с МТС достоверно превалируют образцы УМ с делецией гена ВАР1. Кроме того, наличие амплификации гена ВАР1 чаще отмечали у пациентов без МТС (р=0,002). При этом, как известно из данных мировой литературы, именно делеция гена ВАР1, выявляемая в ДНК УМ, может иметь значение для развития МТС, что, вероятно, связано с его локализацией на 3р. Амплификация гена ВАР1 при УМ не описана, в том числе и как нарушение, способное оказывать влияние на развитие МТС. В связи с этим возникла необходимость в сравнении выживаемости пациентов при нормальном статусе гена ВАР1 и при образовании его дополнительных копий (рис. 5.16).

    Полученные данные выживаемости позволили сделать вывод о том, что различия между выживаемостью пациентов при амплификации и при нормальном статусе гена ВАР1 в УМ отсутствуют (р=0,6), что вместе с ранее описанным преобладанием амплификации в группе пациентов без МТС, обуславливает в дальнейшем выявление нарушений гена ВАР1 по принципу отсутствия или наличия его делеции (табл.5.9)

    Было отмечено статистически достоверное (р=0,0025) превалирование (66%) пациентов с делецией гена ВАР1 в группе пациентов с МТС УМ, при этом в группе пациентов без МТС в 66% определяли нормальный статус гена ВАР1.

    Проведенный по методу Каплана-Майера анализ показал, что у пациентов без делеции гена ВАР1 выживаемость достоверно (р=0,012) выше, чем у пациентов с делецией. Так, 3-летняя и 5-летняя выживаемость составила 63% и 58%, соответственно, для пациентов без делеции против 52% и 36 % для пациентов с делецией (рис.5.17)

     Полученные данные позволили сделать вывод о том, что делеция гена ВАР1 с высокой достоверностью (р=0,012) может являться неблагоприятным фактором прогноза для развития МТС у пациентов с УМ.

    В рамках данной работы нарушения в гене ВАР1 выявляли двумя методами – иммуноцитохимическим и методом MLPA, – результаты которых имели значительные расхождения. Оценивали совпадение экспрессии белка ВАР1, выявляемое иммуногистохимически, с отсутствием делеции гена ВАР1, определяемым методом MLPA, а также отсутствие экспрессии белка ВАР1 и делеции гена ВАР1. Несовпадение результатов отмечали в 53 образцах УМ, что составляет 55%. При этом результаты иммуногистохимического исследования не имели статистической значимости (р=0,6), тогда как результаты при анализе количества копий гена методом MLPA были высоко достоверны (р=0,006) (преобладание делеции в группе пациентов с МТС). Эти наблюдения позволяют косвенно судить о недостаточной надежности иммуногистохимического теста на инактивацию белка BAP1 как минимум для гистологических образцов из парафиновых блоков, что указывает на целесообразность для определения статуса копийности гена ВАР1 в УМ использования метода MLPA.

    Сочетания выявляемых мутационных нарушений

    На первом этапе работы в рамках мутационного анализа были изолированно проанализированы все нарушения, возможно, влияющие на развитие МТС у пациентов с УМ. Среди всего спектра нарушений-«драйверов» и «модификаторов» методом статистического анализа определили значимые: мутации в «горячих точках» генов GNA11 и EIF1AX, а также делецию гена ВАР1. Однако также необходимо исследование сочетания выявляемых нарушений, в том числе в рамках мутационной классификации, и их влияния на развитие МТС УМ.

    Оценивали сочетание возможных нарушений, результаты чего представлены в таблице 5.10.

     Было отмечено, что в одном образце УМ может быть выявлена лишь одно драйверное нарушение, т.е. мутации в генах GNA11 и GNAQ являются взаимоисключающими (р<0,0001). При этом мутация в гене GNAQ достоверно чаще сочеталась с мутацией в EIF1AX (p=0,037).

    Мутации в «горячих точках» гена EIF1AX и SF3B1 также были взаимоисключающими (р=0,3) – ни в одном образце УМ из 96 не выявлено одновременного сочетания нарушений этих генов, однако статистического подтверждения этому найдено не было. Мутация в гене EIF1AX достоверно ассоциирована с отсутствием делеции гена ВАР1 (р<0,0001), что было выявлено в 16 образцах. Показано, что мутация в EIF1AX и делеция ВАР1 не являются взаимоисключающими (р<0.0001) - в одном случае отмечали такое сочетание нарушений в материале УМ у пациента без МТС при сроке наблюдения в 115 мес. Достоверной связи мутации в EIF1AX с веретеноклеточным типом УМ не отмечено (р=0,056).

    Мутация в экзоне 14 гена SF3B1 без потери копии гена ВАР1 отмечена лишь в 7 образцах УМ, 5 из которых имели эпителиоидноклеточное строение по результатам гистологического исследования. Еще в одном случае выявлено сочетание мутации в экзоне 14 гена SF3B1 с делецией гена ВАР1. Ассоциации мутации SF3B1 с присутствием в опухоли эпителиоидных клеток отмечено не было (р=0,1).

    В 48 образцах из всех нарушений-«модификаторов» была обнаружена только делеция гена ВАР1, которая была ассоциирована с наличием в опухоли эпителиоидного компонента (р=0,016). Какой-либо достоверной связи между уровнем экспрессии белка ВАР1 и количеством копий гена ВАР1 отмечено не было (р=0,3).

    Еще в 23 образцах не было выявлено никаких нарушений-«модификаторов», что не имело достоверной связи с клеточным типом УМ (р=0,6).

    5.4.2. Цитогенетичеcкий профиль

    В рамках цитогенетического тестирования проводили поиск основных хромосомных нарушений, характерных для УМ, методом MLPA с использованием набора реагентов «Uveal Melanoma Probemix» (MRC Holland, Голландия). Данный набор реагентов позволяет оценить количество копий хромосом 3, 6 и 8 и короткого плеча хромосомы 1 с использованием 38 маркерных и 12 контрольных (референсных) регионов (см.обработку материла). На возможную прогностическую значимость исследовали 7 маркеров – нарушения копийности регионов 1p, 3p, 3q, 6p, 6q, 8p и 8q. Для каждого из этих маркеров оценивали встречаемость в двух группах образцов (опухоли от пациентов без МТС и с МТС), а также различия в общей выживаемости между маркер-положительными и маркер-отрицательными пациентами.

    Хромосома 1

    По результатам анализа методом MLPA амплификация короткого плеча хромосомы 1 (1p) была выявлена в 1 случае, делеция – в 9, субклональная амплификация – в 11, субклональная делеция – в 16, отсутствие значимых нарушений копийности – в 59 случаях. Процентное соотношение полученных результатов представлено на рисунке 5.18.

    Встречаемость нарушений копийности 1p в двух группах образцов (опухоли от пациентов без МТС и с МТС) суммирована в Табл. 5.13. При этом статистичсекой достоверности в преобладании каких-либо изменений в группах пациентов выявлено не было (р=0,4).

    Для оценки выживаемости пациентов с каждым из нарушений проводили анализ методом Каплана-Майера (рис.5.19).

    Было отмечено, что 3-летняя и 5-летняя выживаемость пациентов с субклональной амплификацией составляет 18%. При этом 3-летнюю выживаемость для пациентов с субклональной делецией, делецией и нормой определяли на уровне 50%, 56% и 66%, соответственно; 5-летнюю – 41%, 56% и 51% (р=0,009). Амплификация региона 1р была выявлена лишь у одного пациента без МТС, что не позволило адекватно оценить данный показатель.

     Однако учитывая одинаковую природу изменений региона 1р при амплификации и субклональной амплификации было принято решение об объединении двух показателей. Достоверное отсутствие выраженных различий между цифрами выживаемости пациентов с делецией, субклональной делецией и нормальным статусом региона 1р, а также в два раза меньший уровень выживаемости пациентов при субклональной амплификации (р=0,009), позволили оценивать статус региона 1р с позиции наличия или отсутствия увеличения копий короткого плеча хромосомы 1.

    Предложенная модель была статистически достоверной (р=0,007) (рис.5.20).

    Уровень 3-х и 5-летней выживаемости без амплификации, включая субклональную, составил 62% и 49%, соответственно.

    Хромосома 3

    Анализ хромосомы 3 проводили по двум направлениям – исследовали количество копий короткого (3р) и длинного плеч (3q). Об одном маркерном регионе 3р – ВАР1 – шла речь в анализе МГТ.

    Методом MLPA исследовали количество копий короткого плеча хромосомы 3 (3р), по результатам которого в 37 образцах выявлена делеция, в 16 – субклональная делеция, в 6 – субклональная амплификация. В 37 случаях не обнаруживали изменений количества копий 3р. Ни в одном случае не было отмечено амплификации исследуемого региона. Встречаемость выявленных нарушений также оценивали в процентном соотношении (рис.5.21).

     Полученные результаты соотносили с группами пациентов с МТС и без МТС (таб. 5.14). Было отмечено, что в группе пациентов без МТС отсутствие каких-либо изменений короткого плеча хромосомы 3 с высокой достоверностью (р=0,001) наблюдается в два раза чаще, чем в группе пациентов с МТС. Делецию региона 3р также, как и субклональную делецию, наоборот, выявляли в два раза чаще у пациентов с МТС (р=0,001).

    Методом Каплана-Майера проводили анализ выживаемости пациентов с выявленными нарушениями региона 3р (рис.5.22), по результатам которого было отмечено, что 3-летняя выживаемость пациентов с делецией и субклональной делецией определяется примерно на одном и том же уровне – 49% и 50%, соответственно. То же явление отмечено и при анализе 5-летенй выживаемости – 31% при обоих нарушениях.

    Разница в уровнях выживаемости при двух нарушениях отсутствовала (р=1,0). Это наблюдение, а также отсутствие противоречий двух нарушений (потеря копии) позволили объединить две группы. При этом 3 -летняя выживаемость пациентов с субклональной амплификацией региона 3р в УМ (50%), совпадающая с выживаемостью пациентов с делецией и субклональной делецией на том же сроке, отличалась от них на отметке в 60 месяцев (5-летняя выживаемость): 50% при субклональной амплификации против 30% и 40% при делеции и субклональной делеции, соответственно. Однако при сравнении выживаемости пациентов при субклональной амплификации в УМ с нормой, а также с делецией, достоверных различий между ними не выявлено (р=0,2 и р=0,7, соответственно). Отсутствие различий в выживаемости, а также малая выборка пациентов с данным нарушением, в настоящий момент и при исследовании данного изменения короткого плеча хромосомы 3 не позволили сделать вывод, как расценивать нарушение – влияет или не влияет на развитие МТС у пациентов с УМ. Единственным фактором, достоверно оказывающим влияние на развитие МТС, в рамках исследования короткого плеча хромосомы 3 явилась его делеция, включая субклональную (р=0,004) (рис 5.23).

    Выявленные изменения региона 3р и гена ВАР1, расположенного на коротком плече хромосомы 3 (см.Мутационное исследование), соотносили между собой. (табл.5.15). Совпадение изменений региона 3р с геном ВАР1 выявляли в 80% случаев (kappa=0,6, 95% ДИ [0,4;0,7]).

    Полученные результаты позволили сделать вывод о том, что использование маркерного региона короткого плеча хромосомы 3 возможно. Однако его предиктивная значимость должна быть определена на большей выборке пациентов с несовпадением результатов.

     При изучении нарушений хромосомы 3 оценивали возможные изменения ее длинного плеча (3q) и их влияние на развитие МТС у пациентов с УМ. При исследовании количества копий 3q в 31 случае не обнаруживали значимых изменений, еще в 3 выявлена субклональная амплификация. Делецию и субклональную делецию выявляли в подавляющем большинстве случаев (рис.5.24) – в 46 и 16, соответственно.

    В процессе оценки распределения полученных результатов в группах пациентов без МТС и с МТС (табл.5.16) было выявлено, что пациенты с нормальным статусом региона 3q более чем в два раза преобладают в группе пациентов без МТС (р=0,007). Отсутствие изменений региона 3q уже на данном этапе указывало на то, что нормальный статус длинного плеча хромосомы 3 следует расценивать как благоприятный фактор.

    Для анализа выживаемости субклональную делецию и делецию объединяли ввиду однородности происходящих изменений, а также ввиду отсутствия статистической разницы в выживаемости пациентов с двумя этими нарушениями (р=0,8) (рис.5.25).

    Отдельного внимания заслуживала субклональная амплификация, отмечаемая лишь в трех случаях и только у пациентов с МТС. Данный факт принимали во внимание, однако для последующего анализа выживаемости данное нарушение не использовали ввиду критически малого количества пациентов. Для оценивания выживаемости при субклональной амплификации необходим дальнейший ретроспективный анализ с повышением выборки таких пациентов.

    Сравнение выживаемости пациентов с делецией и нормальным статусом выявило лучшие результаты у пациентов без каких-либо изменений длинного плеча третьей хромосомы - 3- и 5-летняя выживаемость составила 74% и 66%, соответственно (рис.5.26). При этом уровень 3- и 5-летней выживаемость пациентов с делецией, включая субклональную, был разительно ниже – 52% и 38%, соответственно. Полученные данные были статистически достоверны (р=0,006).

    Проведенный анализ изменений длинного плеча хромосомы 3 показал, что делеция как изолированный объект анализа является негативным явлением, достоверно оказывающим влияние на развитие МТС у пациентов с УМ. Выявленная у малого количества пациентов (n=3) субклональная амплификация в рамках данной работы не может быть расценена как прогностически значимое нарушение. Однако беря во внимание его обнаружение лишь у пациентов с МТС УМ, данное нарушение требует особого внимания и на настоящем этапе должно быть расценено как неблагоприятный фактор.

     На последнем этапе анализа полученных данных соотносили изменения регионов 3р и 3q (табл.5.17).

    Совпадение результатов в 83% случаев (kappa=0,61, 95% ДИ [0,5;0,8]) может свидетельствовать о том, что изменения двух плеч чаще встречаются одновременно (изохромосома), однако не в 100% случаев. Какое из плеч обладает большей предсказательной способностью необходимо выяснить.

    Хромосома 6

    Исследование 6 хромосомы выполняли также по 2 направлениям – оценивали количество копий короткого (6р) и длинного плеч (6q).

    Анализ короткого плеча хромосомы 6 показал, что ни в одном из образцов не определялось делеции и субклональной делеции. В 26 и 33 образцах выявляли амплификацию и субклональную амплификацию, в одном – амплификацию высокой степени. В 35 случаях каких-либо изменений 6р не отмечали. Процентное соотношение полученных результатов исследования региона 6р отображено на рис. 5.27.

     Распределение по группам пациентов с МТС и без МТС оценивали с учетом всех выявленных изменений региона 6р (табл. 5.29). При этом амплификацию высокой степени ввиду встречаемости всего в одном случае объединяли с амплификацией. Неожиданным образом амплификация 6p и субклональная амплификация этого региона продемонстрировали противоположные тенденции в распределении по группам: субклональную амплификацию с тенденцией к достоверности (р=0,06) в два раза чаще выявляли в группе пациентов с МТС, а амплификацию – наоборот, в группе пациентов без МТС.

    Выживаемость оценивали методом Каплана-Майера. В процессе анализа пациенты с амплификацией демонстрировали наиболее высокий уровень выживаемости: 68% и 63% для 3- и 5-лет, соответственно. Выживаемость пациентов с субклональной амплификацией составила 49% и 35% на уровне 3 и 5 лет (рис.5.28). Данные наблюдения находили отражение в распределении пациентов по группам с МТС и без МТС, но не были статистически достоверными (р=0,1).

    Влияния короткого плеча хромосомы 6 на развитие МТС УМ выявлено не было.

    Анализ изменений длинного плеча хромосомы 6 группы из 96 образцов УМ позволил выявить делецию и субклональную делецию в 13 и 8 случаях, соответственно, амплификацию и субклональную амплификацию - в 5 и 21. Почти в половине случаев из всей группы УМ - в 49 образцах - изменений региона 6q не обнаруживали (рис.5.29).

     Группы пациентов с МТС и без МТС отличались по преобладанию делеции и субклональной делеции региона 6q у пациентов с признаками метастатической болезни, а амплификации и субклональной амплификации – у пациентов без признаков МТС при сроках наблюдения свыше 3 лет (табл.5.19). Учитывая выявленные особенности, для последующего анализа выживаемости пограничные значения – субклональную амплификацию и амплификацию, а также делецию и субклональную делецию – объединяли.

    Проведенный в последующем методом Каплана-Майера анализ выживаемости подтвердил сделанное на предыдущем этапе предположении о благоприятной роли амплификации региона 6q. Уровень 3-и 5-летней выживаемости пациентов с увеличением копии длинного плеча хромосомы 6 был выше, чем с делецией и нормой, и составил 80% и 67%, соответственно (р=0,05) (рис.5.30).

    Проведенный анализ выживаемости пациентов с различными изменениями как короткого, так и длинного плеч хромосомы 6, позволил сделать вывод, что амплификация региона 6q может иметь прогностическое значение в качестве благоприятного предиктора при относительно невысоком уровне достоверности (р=0,05).

    На последнем этапе анализа полученных данных оценивали частоту одновременного изменения длинного и короткого плеч хромосомы 6 (табл. 5.20). Была выявлена полная несогласованность результатов (совпадение – 40%, kappa=0,08, 95%ДИ [-0,07;0,2]). Это позволило сделать вывод о том, что анализ всей хромосомы в рамках генетического тестирования с прогностической целью выполнять не имеет смысла.

    Хромосома 8

     Хромосому 8 изучали также по двум направлениям – исследовали короткое плечо и длинное плечо.

    Широкий спектр нарушений хромосомы 8, изучаемый в рамках данный работы, обусловлен необходимостью выделения наиболее значимого изменения, позволяющего (самостоятельно или в купе с прочими генетическими аномалиями) с высокой достоверностью определять риск развития МТС, в том числе при проведении прогностической ТИАБ у пациентов с УМ в будущем.

    По результатам исследования количества копий короткого плеча хромосомы 8 (8p) методом MLPA делецию выявляли в ДНК 11 образцов, субклональную делецию – в 5. Амплификация в различных вариантах имела место в большей части образцов УМ (рис.5.31): амплификацию определяли в 17 случаях, субклональную амплификацию – в 27, а амплификацию высокой степени – в 1 случае. В 35 образцах опухоли регион 8р не имел значимых изменений.

    Выявленные изменения соотносили с группами пациентов с МТС и без МТС (табл.5.21). Было отмечено, что в группе пациентов, имеющих МТС УМ, достоверно чаще превалирует делеция региона 8р (р=0,02), а также с субклональная делеция (р=0,07). При этом амплификацию чаще отмечали в группе пациентов без признаков МТС при сроке наблюдения свыше 3 лет (р=0,02).

     Данные наблюдения нашли подтверждение при проведении анализа выживаемости методом Каплана-Майера (рис. 5.32). Очевидна ассоциация худшей выживаемости пациентов с делецией 8р, включая субклональную. При этом разница в выживаемости при двух этих нарушениях – делеции и субклональной делеции - отсутствовала (р=0,9). Пациенты с амплификацией, субклональной амплификацией, амплификацией высокой степени и нормой достоверно (р=0,0003) лучшую выживаемость. Уровни выживаемости при данных состояниях 8р (амплификация, субклональная амплификация, амплификация высокой степени и норма) также сравнивали между собой – различий выявлено не было (р=0,6).

    Полученные результаты позволили сделать вывод о том, что изменения 8р следует оценивать с точки зрения наличия или отсутствия делеции, включая субклональную, данного региона (рис.5.33).

    Выживаемость пациентов без делеции короткого плеча хромосомы 8 при исследовании предложенной бинарной системы составила 64% и 54% на момент 3 и 5 лет. Уровень 3- и 5-летней выживаемости пациентов с делецией был значительно ниже и определялся на уровне 25% и 6%, соответственно.

    Полученные данные имели высокую статистическую значимость (р<0,0001).

    Кроме того, в рамках исследования хромосомы 8 оценивали состояние ее длинного плеча. Примечательным был тот факт, что при анализе региона 8q выявляли изменения, соответствующие лишь группе амплификации. Собственно амплификацию 8q определяли 37 образцах УМ, субклональную амплификацию – в 14, амплификацию высокой степени – в 19. Нормальным статус региона 8q методом MLPA был определен в 26 случаях. Процентное соотношение полученных результатов исследования длинного плеча хромосомы 8 представлено на рисунке 5.34.

     При анализе распределения выявленных нарушений в УМ по группам пациентов с признаками метастатической болезни и без них (табл.5.22) отмечали, что у пациентов без МТС чаще встречался нормальный статус региона 8q (р<0,0001). Так же с высоким уровнем достоверности (р<0,0001) отмечали преобладание образцов с амплификацией высокой степени в группе пациентов с признаками МТС. Кроме того, у пациентов с МТС почти в два раза чаще выявляли амплификацию длинного плеча хромосомы 8 (р<0,0001). Особого внимания заслуживала субклональная амплификация 8q, наличие которой отмечали чаще у пациентов без МТС.

    Имеющая пограничные значения параметра Ratio (см. обработка и подготовка гистологического материала) с амплификацией и нормой субклональная амплификация требовала дальнейшего исследования в рамках метода Каплана-Майера. Проведенный анализ показал, что разница в выживаемости пациентов с субклональной амплификацией и нормой отсутствует (р=0,4), тогда как разница при субклональной амплификации и амплификации имеет слабую тенденцию к достоверности (р=0,09).

    Полученные данные выживаемости, а также преобладание субклональной амплификации в группе пациентов без МТС (табл.2.9) свидетельствуют о том, что субклональную амплификацию, вероятно, стоит относить к состоянию длинного плеча хромосомы 8, при котором риск развития МТС ниже.

    Кроме того, анализировали разницу в выживаемости пациентов с амплификацией и амплификацией высокой степени. Было отмечено, что с тенденцией к достоверности (р=0,06) пациенты с амплификацией высокой степени имеют выживаемость ниже, чем пациенты с амплификацией (рис. 5.35). Так, уровень 3- и 5-летней выживаемости при амплификации составил 49% и 32%, а при амплификации высокой степени – 26% и 16%, соответственно.

    Для подтверждения выдвигаемого предположения о роли амплификации высокой степени в развитии МТС необходим дополнительный набор пациентов с таким изменением региона 8q. На настоящем этапе работы изменения длинного плеча хромосомы 8 необходимо оценивать с позиции наличия или отсутствия амплификации, включая амплификацию высокой степени (рис.5.36). Существование данного подхода доказано статистически (р<0,0001).

    Сочетание выявляемых цитогенетических нарушений

     Анализ цитогенетического профиля также включал исследование взаимоотношений выявленных значимых изменений между собой (табл. 5.23)

    В анализ включали субклональную амплификацию короткого плеча хромосомы 1 (1р), а также изменения хромосомы 3 – делецию короткого плеча 3р и его маркерного региона (ВАР1) и делецию длинного плеча 3q. Кроме того, оценивали взаимосвязь с другими нарушениями изменения хромосомы 8 – делеции кроткого плеча (8р) и амплификации длинного плеча (8q).

    Отмечали, что в большинстве образцов, в ДНК которых определяли субклональную амплификацию короткого плеча хромосомы 1 (1р), УМ была эпителиоидноклеточной (р=0,04). При этом какой-либо статистически значимой связи субклональной амплификации 1р с иными нарушениями выявлено не было.

    Делеция короткого плеча хромосомы 3 была достоверно ассоциирована с амплификацией длинного плеча хромосомы 8 (р=0,0008). Существование связи делеции региона 3р с наличием эпителиоидного компонента УМ подтверждено статистически (р=0,03).

     Потеря копий гена ВАР1 – маркерный регион короткого плеча хромосомы 3, – была ассоциирована с амплификацией длинного плеча хромосомы 8 (8q) (р=0,0007). Делеция гена ВАР1 достоверно предсказывала наличие эпителиоидных клеток в опухоли (р=0,02).

    Делеция длинного плеча хромосомы 3 достоверно чаще встречалась с делецией как всего короткого плеча той же хромосомы (3р, р<0,0001), так и с ее маркерным регионом – геном ВАР1 (р<0,0001). Одновременная делеция 3р и 3q свидетельствовала о вероятной утрате одной из копий всей хромосомы 3 (полная моносомия 3). Кроме того, делецию 3q чаще отмечали у пациентов с амплификацией 8q (р=0,04). Достоверной связи потери копии региона 3q с эпителиоидноклеточным типом УМ выявлено не было (р=0,6).

    Потеря копии короткого плеча хромосомы 8 чаще наблюдали у пациентов с делецией региона 3р (р=0,02), а также в случаях эпителиоидноклеточной УМ (р=0,001). Также, как и в случае с хромосомой 3, изменения короткого плеча хромосомы 8 достоверно чаще встречали одновременно с изменениями длинного плеча. Так, амплификацию 8q отмечали в образцах с делецией 8р (0,0017). Кроме того, амплификация региона 8q была ассоциирована с эпителиоидноклеточным типом УМ (р=0,004).

    5.4.3. Многофакторный анализ прогностической значимости мутационных и цитогенетических нарушений

    В процессе исследования цитогенетического и мутационного профиля опухолей 96 пациентов с МТС и без МТС был выделен спектр маркеров, имеющих статистически достоверную связь с риском диссеминации УМ. Учитывая необходимость разработки прогностической панели, способной предсказывать риск развития МТС у пациентов с УМ с высокой точностью, в том числе на относительно небольшом количестве материале ТИАБ, вставал вопрос о выделении наиболее значимых нарушений среди полного спектра. Данный анализ осуществляли методом пропорциональной регрессии рисков Кокса.

     По результатам исследования мутационного профиля было показано, что статистическую значимость в выживаемости пациентов с УМ имеют мутации гена EIF1AX, GNA11, а также делеция гена ВАР1. Именно эти изменения мутационного профиля вошли в модель многофакторного анализа (таблица 5.24).

    В процессе анализа показано, что риск возникновения МТС у пациентов с мутацией в EIF1AX почти в 3 раз ниже, чем без нее (р=0,003). При этом в заданной модели (р<0,0001) никакие другие нарушения статистической значимости не имели.

    В процессе цитогенетического исследования был выделен спектр прогностически значимых маркеров, включающих регион 1р, 6q, 3р, 3q, 8p и 8q. Учитывая разработки прогностической панели, способной предсказывать риск развития МТС у пациентов с УМ с высокой точностью, в том числе на относительно небольшом количестве материале ТИАБ, вставал вопрос о выделении наиболее значимых нарушений. Данный анализ осуществляли методом пропорциональной регрессии рисков Кокса.

    Для этого на первом этапе методом пропорциональной регрессии рисков Кокса в анализ включали делецию короткого (3р) и длинного (3q). В процессе исследования из модели (р=0,005) была исключена переменная 3q ввиду отсутствия ее статистической значимости (р>0,05). С высокой достоверностью (р=0,002) было показано, что риск возникновения МТС у пациентов с делецией региона 3р в 2,5 раза выше, чем у пациентов без нее.

     Четвертый прогностический класс по цитогенетической классификации подразумевает наличие любой из аберраций хромосомы 8. В рамках данного исследования оценивали встречаемость и влияние на развитие МТС УМ описанных изменений хромосомы 8. Это, как и в случае с хромосомой 3, среди делеции 8р и амплификации 8q потребовало выделения наиболее значимого изменения для последующей стратификации риска развития МТС у пациентов на материале ТИАБ.

    Регрессионная модель Кокса (р<0,0001) выявила значимость как амплификации региона 8q (р=0,004), так и делецию региона 8р (р=0,048). Далее в регрессионную модель Кокса включали 1р, 6q, 3р, 8р и 8q (P < 0,0001). Было выявлено, что статистически значимыми являются изменения лишь 8 хромосомы – длинного и короткого плеч (табл.5.25).

    Выявленные значения потребовали последующего изучения влияния двух факторов на возникновение МТС, что стало причиной проведения анализа выживаемости пациентов трех групп: с делецией региона 8р, с амплификацией региона 8q и с двумя этими нарушениями одновременно (рис.5.37).

    Проведенный методом Каплана-Майера анализ показал, что выживаемость пациентов с выявляемой в опухолевой ДНК амплификацией региона 8q и делецией региона 8р ниже, чем без делеции, и составляет 26% и 7% для 3 и 5 лет, соответственно. Уровень выживаемости при амплификации 8q определяли на уровне 35% и 47% для тех же показателей. Полученные данные позволили сделать вывод о необходимости выделения двух прогностических единиц: амплификации региона 8q как более благоприятного и комбинации делеции региона 8р с амплификацией региона 8q как менее благоприятного (р<0,0001).

    Таким образом, в прогностическую панель факторов, имеющих влияние на развитие МТС УМ и возможных для определения в рамках ТИАБ, должны быть включены те, которые, как показано в данном исследовании, имеют статистически достоверную связь с МТС УМ. Среди морфологических факторов для выявления пациентов с УМ высокого риска важным маркером является наличие эпителиоидных клеток в материале ТИАБ. Среди генетических факторов изменения регионов 8р и 8q, а также мутации гена EIF1AX, необходимо расценивать как маркеры, обладающие наибольшей предиктивной силой. Изменения регионов 1р,3р, 6q, а также мутация гена GNAQ, как показало исследование, имеют связь с развитием МТС УМ, однако обладают меньшим прогностическим потенциалом. Разработанная панель является неотъемлемой частью прогностической ТИАБ.