Лабораторные методы исследования

    Оценка наличия вирусного инфицирования

    Для изучения наличия или отсутствия аденовируса у пациентов на разных стадиях течения пленчатой формы АВКК проводилось качественное (+/-) исследование ДНК аденовируса методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в мазках с конъюнктивы. Исследование проводилось на базе КДЦ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, г. Москва. Для проведения исследования были набраны две группы пациентов (65 человек). В первую группу были отобраны 45 человек с острой пленчатой формой АВКК, у которых исследование проводили на этапах 1-3 сутки, 10-14 сутки, 1 месяц и 3 месяца от начала заболевания с целью определения наличия аденовируса на разных этапах развития и лечения заболевания. Пленчатая форма АВКК была выбрана для динамического определения ДНК аденовируса, как наиболее тяжелый вариант течения процесса. Так же выбор связан с характерной стадийностью клинического течения заболевания у пациентов с данной патологией. Одной из стадий при этом является инфильтративное поражение роговицы в исходе острого периода заболевания.

    Кроме того, ПЦР диагностику ДНК аденовируса проводили 20-ти пациентам с повторным формированием постаденовирусного поражения роговицы в отдаленные сроки после перенесенного острого периода АВКК в условиях отсутствия воспалительной реакции со стороны конъюнктивы. В данной группе исследование проводили в следующие сроки: до начала лечения, а также на сроках 1 и 3 месяца от начала лечения (при наличии положительного результата при первичной диагностике) (см. красный сектор в схеме дизайна исследования, стр. 40-41).

    Исследование проводили с помощью набора реагентов для амплификации ДНК аденовируса с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле («АмплиСенс Adenovirus-EPh», Россия). Забор материала проводили с помощью стерильного зонда и помещали в транспортную среду при температуре 2-8°С. В лизирующий раствор, прогретый до температуры 65 °С, вносили 50 мкл пробы. Затем его подвергали центрифугированию (5 тыс. об/мин) на микроцентрифуге в течение 5 секунд. После добавления сорбента универсального и перемешивания проводили его осаждение путем центрифугирования.

    Полученные пробы подвергали двукратной процедуре отмывки и центрифугирования с удалением надосадочной жидкости. Затем пробирки помещали в термостат на 5 минут при температуре 65 °С для подсушивания сорбента. В пробирки добавляли ТЕ-буфер для эволюции ДНК, прогревали до 65 °С и подвергали центрифугированию в течение 1 минуты. Полученную надосадочную жидк ость использовали для определения ДНК аденовируса.

    Пробирки с пробами помещали в амплификатор на режиме паузы в момент достижения температуры в ячейках 95 °С. Время амплификации составило 2 часа, после чего полученный раствор помещали в заранее подготовленные лунки агарозного геля и подвергали элетрофорезу в течение 18-20 минут при напряжении 250В со стабилизацией по напряжению. Результаты ПЦР диагностики оценивали по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК.

    Оценка системного аутоиммунного ответа

    С целью оценки системного аутоиммунного ответа было проведено исследование крови на аутосенсибилизацию к антигенам роговицы пациентов с инфильтративным поражением роговицы после перенесенного АВКК. Для этого была отобрана группа пациентов с упорным рецидивированием поражения роговицы вне зависимости от проводимой терапии (10 пациентов) (см. розовый сектор в схеме дизайна исследования, стр. 40-41).

    Исследование проводилось на базе лаборатории иммунологии, вирусологии и микробиологии ФГБУ «МНИИ ГБ им. Гельмгольца».

    Системный (клеточный) иммунный ответ на антигены роговицы оценивали с помощью реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) в капиллярном тесте. Количественный учет результатов РТМЛ производили по индексу миграции (ИМ), который представляет соотношение площадей миграции лейкоцитов в опытном экземпляре, где проверяли реакцию с антигеном, и в контрольном варианте, который представлен в виде среды RPMI 1640 «Sigma» без добавления антигена. Исходя из ранее накопленных данных лаборатории иммунологии и вирусологии ФГБУ «МНИИ ГБ им. Гельмгольца», при оценке результатов за норму принимали интервал ИМ от 0,80 до 1,20. При этом показатели ниже 0,80 расценивали как «торможение» миграции лейкоцитов, а данные выше 1,20 – как «стимуляцию» миграции лейкоцитов. Оба типа ответа считали положительной реакцией, отражавшей системную аутосенсибилизацию больного.

    Оценка локального цитокинового статуса

    В группах с наиболее значимыми клиническими результатами терапии постаденовирусного поражения роговицы было проведено динамическое изучение локального иммунологического статуса путем изучения экспрессии генов цитокинов в культуре клеток конъюнктивального соскоба и определения содержания самих цитокинов в надосадочной жидкости. Исследование проводили на базе ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи Минздрава России, подразделение Институт вирусологии имени Д.И.Ивановского, г. Москва. Изучение локального цитокинового профиля проводили у 30 пациентов (30 глаз) до начала терапии. А также исследование было проведено у пациентов в группах терапии: Группа I – монотерапия кортикостероидами – 32 человека (32 глаза); Группа III – комбинация кортикостероидов и ЦсА – 33 человека (33 глаза)). При этом при наличии бинокулярного поражения роговицы выбирался глаз с более выраженными изменениями, приводящими к значительному изменению функций. В группах лечения исследование проводили на сроках 1 и 4 месяца от начала терапии. Подробное описание групп терапии представлено в пункте 2.5.

    Кроме того, для корректной интерпретации результатов исследование было проведено у группы здоровых добровольцев – 30 человек (30 глаз) (см. черный сектор в схеме дизайна исследования, стр. 40-41).

    Качественный анализ, то есть наличие или отсутствие экспрессии генов 16 цитокинов (ИФН-α, ИФН-β, ИФН-γ, ИФН-λ1, ИФН-λ2, ИФН-λ3, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-17, ИЛ-18, ФНО-α), проводили с помощью методов обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) путем определения их матричной РНК (мРНК).

    Субстратом для анализа служил свежий материал из клеточной культуры соскоба с конъюнктивы. Выделение тотальной РНК проводили по методике, предложенной P . Chomczynski, N. Sacchi в 1987 г. [37], согласно которой использовали метод кислой гуанидин тиоцианат-фенол-хлороформ экстракции. Лизат переносили в чистую пробирку и добавляли равный объем смеси фенол-хлороформ-изоамилового спирта (25:24:1). Полученную смесь интенсивно встряхивали (10 секунд) и центрифугировали при 12 тыс. об/мин в течение 15 минут. Затем брали надосадочную жидкость, добавляли равный объем изопропанола и оставляли при –20 °С на 6-8 часов, после чего центрифугировали спиртовую смесь при 12 тыс. об/мин в течение 15 минут для осаждения тотальной РНК и удаляли супернатант. Полученную РНК промывали охлажденным 75%-м этанолом, подсушивали при комнатной температуре в течение 5-6 минут и растворяли в 40 мкл стерильной воды.

    Определение количества выделенной РНК производили фотометрическим методом. На спектрофотометре измеряли поглощение раствора РНК при длине волны 260 нм. О степени очистки препаратов тотальной РНК от примесей белка или фенола судили, сопоставляя величины оптической плотности, полученные при 260 нм и 280 нм. Обратная транскрипция и ПЦР -амплификация были выполнены в соответствии с методикой, предложенной Gelder. После проведения обратной транскрипции помещали полученную к опию ДНК (кДНК) на хранение в морозильник при – 20 °С. ПЦР проводили в объеме 25 мкл на программируемом амплификаторе МС 2 (АО «ДНК-технология», г. Москва). После 26 циклов полимеразной цепной реакции для получения полноразмерных ПЦР-продуктов вели достройку синтезированной ДНК в течение 7 минут при 72°С. После амплификации продукты ПЦР анализировали электрофоретически в 2,5% агарозном геле. В качестве позитивного контроля амплификации использовали β-actin. Электрофорез кДНК проводили в 2,5% агарозном геле с бромистым этидием (0,5мкг/мл) в Трис-ацетатном буфере, содержащем 0,2 М ЭДТА. Электрофорез вели в течение 35 минут в камерах для горизонтального электрофореза фирмы BioRad Laboratories, Inc. Фотографировали на пленку Микрат-500 под мягким (360нм) ультрафиолетовым освещением. Для идентификации нуклеотидных последовательностей использовали маркер для электрофореза (G 1758) фирмы Promega, США.

    Количественную оценку проводили для 6 цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИФН-α), которые были определены для исследования после первого этапа диагностики. Содержание цитокинов определяли в надосадочной жидкости с клеточной культуры соскоба с конъюнктивы методом иммуноферментного анализа (ИФА). Результат фиксировали в пкг/мл. Были использованы тест-системы «Вектор-БЕСТ» (Россия). Метод определения основан на техстадийном «сэндвич»-варианте твердофазного ИФА с использованием моноклональных антител к указанным цитокинам.

    На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы инкубировали в лунках с иммобилизованными антителами, с которыми связывается имеющийся в образцах цитокин, соответствующий конкретному набору. Для этого во все лунки вносили по 100 мкл раствора для разведения образцов, затем – по 100 мкл калибровочных или исследуемых образцов в каждую лунку. Полученные смеси инкубировали при температуре 18-20 °С в течение 120 минут в термостатируемом шейкере с частотой 700 об/мин. Затем с помощью промывочного устройства промывали лунки планшета 5 раз, после чего в лунки вносили по 100 мкл рабочего раствора конъюгата № 1. Инкубировали при температуре 18-20 °С в течение 60 минут в шейкере с частотой 700 об/мин и повторяли пятикратную процедуру промывки. Затем вносили в лунки планшета рабочий раствор конъюгата № 2 в количестве 100 мкл и инкубировали в течение 30 минут в шейкере при температуре 18-20 °С с частотой 700 об/мин, после чего снова промывали лунки планшета.

    Следующим этапом производили добавление рабочего раствора тетраметилбензидина (100 мкл) во все лунки и выдерживали планшет в защищенном от света месте в течение 25 минут при температуре 18 -20 °С. После чего вносили стоп-реагент в лунки в количестве 100 мкл в той же последовательности, что и предыдущий рабочий раствор. Измерение оптической плотности производили с помощью спектрофотометра в двухволновом режиме: основной фильтр – 450 нм, референс-фильтр – 620 нм.

    По результатам измерения вычисляли среднее арифметическое значение оптической плотности в лунках с анализируемыми образцами и производили построение калибровочного графика, с помощью которого определяли искомое значения содержания цитокина в образце.