Рисунок 2 – Биоимплантат с нанодисперсной плацентой человека
Рисунок 3 – Биоимплантат с нанодисперсной плацентой человека, консервированный в 0,2 % спиртовом растворе тимола, содержащего хлорид лития, приготовленный к введению экстрабульбарно
В дальнейшем плацента в условиях отделения «Биопласт» в БУЗ УР «Республиканская офтальмологическая клиническая больница МЗ УР» (лицензия № ЛО-18-01-001416 от 15.05.2014 на данный род деятельности) отделялась от амниотической оболочки, промывалась в течение 3-х суток от крови по следующей методике. Вначале плацента целиком погружалась в контейнер с 20 % раствором альбуцида. В течение вторых суток плацентарная ткань промывалась в стерильном изотоническом растворе натрия хлорида с содержанием антибиотика (пенициллин из расчёта 1,0 г сухого вещества на 100,0 мл физиологического раствора). На третьи сутки изотонический раствор натрия хлорида с содержанием антибиотика менялся на «свежий». В последующем после стекания свободной прозрачной жидкости (промывной раствор натрия хлорида) плацента замораживалась при температуре минус 18 – 20 ° С и подвергалась лиофилизации, при этом заморозка осуществлялась в течение суток при температуре минус 45 – 50 ° С в установке для сублимационной сушки LZ-9.2 (Чехия). Затем производилась последующая сушка в условиях вакуума (40 – 50 Ра) при температуре плюс 22 0 С в течение суток.
2.2.1 Методика получения нанодисперсного материала
Для приготовления порошка плаценты ультрадисперсной структуры в дальнейшем лиофильно-высушенная плацента человека подвергалась механическому измельчению до консистенции порошка с макродисперсной организацией структуры (размеры зёрен в диаметре более 45 мкм) в измельчительном устройстве, сконструированном по типу кофемолки. Затем порошок крупнодисперной плаценты измельчался повторно методом механоактивации в шаровой планетарной мельнице «Pulverezette 7» (Fritsch, Германия) в отделе физики и химии наноматериалов в ФГБУ ФТИ УрО РАН (г. Ижевск). Порошок нанодисперсной плаценты получали при температуре не более 60 ° С и величины подведённой удельной энергии 0,4-100 кДж/г. На методику получения нанодисперсной плаценты – «Способ приготовления биофункционального трансплантата в виде наночастиц» получен Патент РФ № 2367448 (приоритет от 09.01.2008 г.). При этом сосуды (объёмом 150 мл) и шары (диаметром 8 мм) шаровой планетарной мельницы были изготовлены из упрочнённой нержавеющей и шарикоподшипниковой стали соответственно. Масса исходного загружаемого порошка крупноизмельчённой плаценты была 2 г. Общая масса шаров составляла 200 г.
Учитывая официальное разрешение на применение нанодисперсного титана в медицинской практике, активное использование его композитов в стоматологии в качестве зубных имплантатов [93, 94, 248], различных титановых конструкций с наноструктурным биопокрытием в челюстно-лицевой хирургии [190], а также в ортопедии и травматологии в качестве искусственных коленных, тазобедренных и других суставов [29, 321, 349], также изучалось в работе воздействие нанодисперного титана (небиологического материала) на соединительнотканные структуры глаза экспериментального животного. Целью данного исследования явилось изучение влияния частиц нанодисперсного титана на регенераторные процессы соединительнотканных структур глаза опытного животного и возможности индуцирования ими процессов репарации. Для этого приготавливали нанодисперсный титан. При этом порошок титана чистотой 99.9, так же, как и порошок плаценты, подвергался механоактивации в шаровой планетарной мельнице АГО-2С (Россия) в присутствии толуола в течение 10 мин [232]. Сосуды (объёмом 150 мл) и шары (диаметром 8 мм) шаровой мельницы были изготовлены из упрочненной нержавеющей и шарикоподшипниковой стали соответственно. Масса загружаемого порошка была 10 г, а объём толуола составлял 50 мл. Общая масса шаров составляла 200 г.
2.2.2 Методика приготовления биоимплантата для экстрабульбарного применения
Фрагмент пуповины для приготовления биоимплантата получали из отрезка сосуда пуповины по следующей методике. Вначале отделенная от плаценты пуповина промывалась в течение 3-х суток от крови: в первые сутки пуповина целиком погружалась в контейнер с 20 % раствором альбуцида. В течение вторых суток пуповина промывалась в стерильном изотоническом растворе натрия хлорида с содержанием антибиотика (пенициллин из расчёта 1,0 г сухого вещества на 100,0 мл физиологического раствора). Затем в стерильных условиях хирургическим способом выделялись сосуды пуповины. Также с помощью шприца объёмом 20,0 мл с тупоконечной канюлей промывалась полость сосуда, кроме того содержимое сосуда выжималось методом сдавления между двумя пальцами с последующим вытягиванием сосуда за один из его концов. На третьи сутки изотонический раствор натрия хлорида с содержанием антибиотика менялся на «свежий». В дальнейшем сосуды пуповины помещались в спиртовый 0,2 % раствор тимола с хлоридом лития [72, 224] и находились в консерванте в условиях холодильной камеры в течение 1 месяца для ликвидации клеточных элементов стенки сосуда. Затем сосуды пуповины извлекались из консерванта, заполнялись порошком приговленной ранее нанодисперсной плаценты, разрезались на отдельные фрагметы размером (10,0 ± 1,0) × (2,0 ± 0,5) мм для применения в опыте на кроликах и (3,0 ± 0,5) × (1,0 ± 0,2) мм для применения в эксперименте на крысах, концы при этом завязывались биологической нитью (шёлк 8/0). Общий вид биоимплантата представлен на Рисунке 2.
На такой биоимплантат, представленный фрагментом отрезка сосуда пуповины и содержащий нанодисперсную плаценту – «Биологический контейнер для реваскуляризации соединительной ткани», получен Патент РФ № 2369361 (приоритет от 04.04.2008 г.).
По аналогии с нанодисперсной плацентой нанодисперсный титан, полученный методом механоактивации, для дальнейшего применения в эксперименте помещался в подобный фрагмент отрезка сосуда пуповины, концы которого также завязывались.
Готовый биоимплантат помещался в стерильную стеклянную тару (пенициллиновый пузырёк) с консервантом, запечатывался и хранился в условиях холодильной камеры при при температуре 4-8 ° С (Рисунок 3). Такой метод применяется в условиях отделения по забору, приготовлению, консервации и хранению биологических материалов «Биопласт» в БУЗ УР «Республиканская офтальмологическая клиническая больница МЗ УР» с момента его открытия с 1988 года благодаря научным разработкам проф. Зайковой М.В. и зарекомендовал собой как простой, но надежный метод консервации. Применяемый при этом в консерванте спиртовый расвор тимола является высокоэффективным антисептическим препаратом, а хлорид лития действует как иммунодепрессант и снижает в послеоперационном периоде реакцию тканей реципиента на пересаженный биоимплантат [72, 224].
Для изучения реакции тканей глаза на имплантацию вышеописанных изделий на предварительном этапе работы проводилась первая серия исследований на крысах (2 группы, n = 24). Первая опытная группа (n = 12) – разрез конъюнктивы глаза животного в верхне-наружном квадранте в 2 мм от лимба, введение под конъюнктиву на склеру биоимплантата, заполненного нанодисперсной плацентой. Вторая опытная группа (n = 12) – аналогичный разрез конъюнктивы глаза животного, имплантация биоимплантата с содержанием нанодисперсного титана. Экспериментальные исследования проведены с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». В протоколах опытов регистрировали реакцию глаза на произведённую имплантацию, состояние пересаженного имплантата, состояние послеоперационной раны конъюнктивы. При этом морфологические исследования тканей глазного яблока животных выполняли через 3, 7, 30 и 60 суток после имплантации. Гистологические препараты приготовлялись стандартно и изучались общегистологическими методами.
Забой крыс производили под наркозом – внутримышечное введение 0,15 мл препарата Золетил, животных выводили из эксперимента методом декапитации.
Во второй серии предварительного этапа исследования также проводилась оценка регенеративной активности соединительнотканных структур глаза в зависимости от объёмов введённой нанодисперсной плаценты.
Для этого проводили экспериментальные исследования на крысах (n = 80). Первоначально приготовляли суспензию нанодисперсной плаценты, смешивая её порошок (сухое вещество) с 0,08 ± 0,01 мл физиологического раствора (0,9 % раствор натрия хлорида). Введение суспензии производилось в верхне-наружном квадранте глазного яблока под конъюнктиву с помощью иглы диаметром 0,3 мм (29 G). В первой опытной группе (n = 20) применяли суспензию из расчёта 5 мг сухого вещества. Во второй опытной группе (n = 20) произведено введение суспензии из расчёта 15 мг сухого вещества. В третьей опытной группе (n = 20) вводилось суспензии нанодисперной плаценты из расчёта 25 мг сухого вещества. Животным четвёртой группы (контроль, n = 20) вводили под конъюнктиву физиологический раствор в объёме 0,08 ± 0,01 мл. В протоколах опытов регистрировали реакцию глаза на введённую дозу суспензии нанодисперной плаценты. Изучены группы животных к концу 3, 7, 14 и 30 суток после манипуляций.
Сроки экспериментального исследования определялись видовыми особенностями исследуемых животных, так, у крыс период ограниченный 60 сутками, соответствует 102-104 месяцам (8,5-8,6 лет) жизни человека [48].
Энуклеированные глазные яблоки животных фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина. Парафиновые срезы окрашивались стандартно, изучались оптической микроскопией и сканирующей зондовой лабораторией ИНТЕГРА Прима (НТ-МДТ, Россия).
2.2.3 Методы исследования нанодисперсного материала
Структурно-фазовый анализ порошка исходной (крупноизмельчённой – до механоактивации) и нанодисперсной плаценты проводился методом рентгеновской дифракции (РД) на дифрактометре ДРОН-3 (Буревестник, Россия) в монохроматизированном CuKα -излучении. Метод РД, снованный на использовании рентгеновских излучений с длиной волны, соизмеримой с расстоянием между структурными элементами кристаллов, позволяет исследовать фазовый состав вещества, проводить его качественный и количественный анализ.
Съёмку рентгеновской дифрактограммы для порошка титана после механоактивации проводили на дифрактометре D8 Advance (Bruker AXS GmbH, Германия) в монохроматизированном CuKα излучении. Для оценки структурных и субструктурных параметров образца использовали программу TOPAS 4.2 путём полнопрофильного анализа Ритвелда.
Контроль плаценты до и после механоактивации проводили методом Фурье-ИК-спектроскопии на спектрометре Excalibur 3100 (Varian, США). При этом метод инфракрасной спектроскопии (ИК-спектроскопии) даёт возможность получить сведения об относительных положениях молекул в течение очень коротких промежутков времени, а также оценить характер связи между ними, что является принципиально важным при изучении структурно-информационных свойств различных веществ. Метод инфракрасной спектроскопии является универсальным физико-химическим методом, который применяется в исследовании структурных особенностей различных органических и неорганических соединений, основан на явлении поглощения группами атомов испытуемого объекта электромагнитных излучений в инфракрасном диапазоне. Поглощение связано с возбуждением молекулярных колебаний квантами инфракрасного света. При облучении молекулы инфракрасным излучением поглощаются только те кванты, частоты которых соответствуют частотам валентных, деформационных и либрационных колебаний молекул.
Анализ на возможное привнесение примесей в образцы плаценты при механоактивации проводился методом атомной эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной плазмой на приборе Spectoflame Modula (Spectro Analytical Instruments, Германия). Метод атомно-эмиссионной спектроскопии, основанный на термическом возбуждении свободных атомов или одноатомных ионов и регистрации оптического спектра испускания возбужденных атомов, служит для качественного обнаружения в полуколичественном или точном количественном определении элементов в анализируемом веществе.
Структуру частиц титана после механоактивации исследовали с помощью растрового электронного микроскопа (РЭМ) Philips SEM 515 (Нидерланды) при ускоряющем напряжении 10 кВ. РЭМ, основанный на принципе взаимодействия электронного пучка с веществом, предназначен для получения изображения поверхности объекта с высоким пространственным разрешением (несколько нанометров). При этом порошок наносился на предметный столик, покрытый тонким слоем токопроводящего спирторастворимого никельсодержащего клея.
Исследования структуры порошка нанодисперсной плаценты проводились на сканирующей зондовой лаборатории ИНТЕГРА Прима (НТ-МДТ, Россия) в прерывисто-контактной методике на воздухе. Порошок измельчённой нанодисперсной плаценты предварительно крепился на пленку полистирола, полученную испарением этилацетата из раствора полистирола в этилацетате. Плёнка наносилась на ситал, с последующим закреплением порошка под ультрафиолетовым излучением. Данная методика исследования, основанная на регистрации взаимодействия микроскопического зонда с поверхностью образца во время сканирования, позоляет произвести оценку его структуры, а также изучить локальные свойства вещества (жёсткость, упругость, механические свойства и др.).
