В первой серии основного этапа исследования производилась оценка биологических эффектов и морфологических механизмов регенеративных процессов в тканях глаза опытных животных при введении биоимплантата с нанодисперсной плацентой и определения глубины её проникновения в склеру.
Проводилось исследование на кроликах породы Шиншилла в возрасте от года до двух лет обоего пола с массой тела от 3,0 до 3,5 кг (4 группы, n = 72; 144 глаза). Первая опытная группа (n = 18) – под местной инстилляционной анестезией 0,5 % раствором алкаина разрез конъюнктивы глаза животного в верхне-наружном квадранте в 3-4 мм от лимба, формировали тоннель к заднему полюсу глаза. Под конъюнктиву на склеру глаза животного вводился биоимплантат на основе фрагмента сосуда пуповины, заполненный нанодисперсной плацентой, размерами (10,0 ± 1,0) × (2,0 ± 0,5) мм (Рисунок 4). Вторая опытная группа (n = 18) – подобный разрез конъюнктивы глаза животного, имплантация аналогичного размера биоимплантата с крупнодисперсной плацентой (исходной, до механоактивации с размерами зёрен более 45-50 мкм). Первая контрольная группа (n = 18) – введение биоимплантата, представленного фрагментом сосуда пуповины, без его предварительного наполнения. Вторая контрольная группа (n = 18) – разрез конъюнктивы без введения биоимплантата.
Экспериментальные исследования проводились с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». Кроликов выводили из эксперимента методом воздушной эмболии под тиопенталовым наркозом (30 мг/кг внутримышечно). При этом морфологические исследования тканей глазного яблока животных выполняли через 3, 7, 14, 30, 60 и 90 суток после имплантации.
У кролика исследовалась реакция на имплантат в течение 90 суток, что приблизительно соответствовало 10 годам жизни человека [453]. Следовательно, полученные ответы позволяли судить о возможных отдаленных реакциях тканей реципиента на имплантацию биоимплантата.
Для общегистологического исследования образцы биоимплантата с нанодисперсной и крупнодисперсной плацентой, а также фрагмент участка сосуда пуповины фиксировали в 10 % нейтральном формалине и заливали в парафин. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилин-эозином и по методике Ван-Гизон.
Энуклеированные глазные яблоки животных также фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина. Парафиновые срезы изучались общегистологичекими методами и сканирующей зондовой лабораторией ИНТЕГРА Прима (НТ-МДТ, Россия), а также методами конфокальной микроскопии и флуоресцентной спектроскопии на ИНТЕГРА Спектра (НТ-МДТ, Россия).
2.3.1 Клинические методы исследования животных после экстрабульбарного введения биоимплантата
В ходе проведённых экспериментальных исследований применялись клинические методы исследования:
- наружный осмотр;
- биомикроскопия переднего отрезка глаза;
- офтальмоскопия глазного дна;
- фоторегистрация.
Рисунок 5 – Общий вид биоимплантата, применяемого в условиях эксперимента на крысах
Таблица 2 – Методы и объём экспериментальных исследований у кроликов
1) наличие отделяемого из конъюнктивального мешка глаза опытного животного и его количество;
2) степень выраженности конъюнктивальной инъекции зоны введения биоимплантата экстрабульбарно;
3) степень выбухания биоимплантата из-под слизистой оболочки;
4) степень расширения эписклеральных сосудов вокруг зоны имплантации;
5) степень отёка слизистой глаза опытного животного;
6) прозрачность роговицы и влаги передней камеры, наличие экссудации в передней камере;
7) наличие признаков иридоциклита по выраженности отёка стромы радужки и наличию задних синехий.
Офтальмоскопия выполнялась при помощи прямого офтальмоскопа Heine BETA 200 S (Heine, Германия), при этом изучали:
1) прозрачность оптических сред;
2) состояние глазного дна.
Фотографирование осуществлялось с помощью фотокамеры Canon EOS 1100D (Canon, Тайвань).
2.3.2 Методы исследования морфологии биологических эффектов применения биоимплантата экстрабульбарно
Морфологию клеток на гистологических срезах исследовали на световом микроскопе Leica DM 2500 (Leica, Германия) с камерой DFC 450 при х50, х100, х200, х400 кратном увеличении с последующим фотографированием. Для более точного представления о размере клеток, диаметре капилляров, площади сечения сосуда проводили измерение с помощью компьютерной программы Scion Image for Windows.
На основе общепринятых морфометрических показателей более детальное изучение трофического обеспечения тканей глаза определялось путём подсчёта удельной длины сосудов на единицу объёма по формуле Блинкова-Моисеева (1961) (1.1). , (1.1)
где, Lv – удельная длина капилляров (мм /мм³ ) в единице объёма образца; ns – число капилляров на площади S среза; n r – число пересечений фрагментов сосудов с линией длиной √S , расположенной произвольно в плоскости гистологического среза; n b – число пересечений фрагментов сосудов с линией такой же длины √S , расположенной перпендикулярной первой.
Учитывая распределение капилляров случайным образом, при котором nr становится равным nb (nr = nb ), формула (1.1) приобретает вид:
Lv = 4n/ S, (1.2)
где Lv – удельная длина капилляров (мм / мм³ ) в единице объёма образца; n – число капилляров на исследуемой площади гистологического среза; S – площадь зоны васкуляризации (мм² ).
Состояние соединительной ткани глаза кролика в зоне хирургической манипуляции изучали путём выявления белка виментина, являющегося белком промежуточных филаментов цитоплазмы клеток соединительных тканей, который, в свою очередь, используется как маркёр мезодермальных тканей [272, 330, 358, 381, 446, 458, 462].
Иммуногистохимическое выявление антигенов в образцах тканей глаза кролика проводили непрямым иммунопероксидазным методом на парафиновых срезах тканей, фиксированных в формалине. При этом набранный материал фиксировали в течение суток в забуференном формалине (1:10, рН 7,4), промывали, обезвоживали и заливали в парафиновую среду «Histomix», после чего изготавливали срезы толщиной 5 мкм и монтировали на предметные стекла с поли-L-лизиновым покрытием. В работе использовали концентрированные кроличьи моноклональные антитела к виментину человека производства Spring bioscience (clone sp20), разведённые дилюентом в пропорции 1:200 (разведение и перекрестную видовую реактивность антител определяли экспериментальным путём). Для визуализации использовали компоненты системы детекции «REVEAL Polyvalent HPR-DAB Detection System» производства Spring Bioscience по протоколу, рекомендованному производителем. При этом последовательно депарафинировали и регидратировали срезы, инкубировали 10 минут в “Hydrogen Repoxide Block”, отмывали в фосфатном буферном растворе (PBS), после чего инкубировали 10 минут в «Protein Block», отмывали в PBS и наносили рабочие растворы первичных антител, которые выдерживали на срезах 30 минут при комнатной температуре во влажной камере. Демаскировка антигенов не проводилась. После трёхкратной отмывки в PBS наносили на срезы «HRP conjugate», инкубировали 15 минут при комнатной температуре, 4 раза отмывали в PBS и наносили на 10 минут хромоген (смесь «DAB Chromogen» и «DAB Substrate»в пропорции 1:50). Затем отмывали в PBS и проводили докрашивание образцов гематоксилином, после чего производили обезвоживание и заключение в «Bio mount».
Для изучения степени созревания коллагенового волокна как маркёра регенераторного процесса гистологические срезы изучались методом атомно-силовой микроскопии (АСМ), позволяющей выявлять пространственные и плотностные свойства биологических объектов в условиях относительно простой их предварительной подготовки и фиксации, а также выяснять с её помощью топографические особенности и упругие свойства биологических объектов, оценивать структурную организацию сложных субклеточных образований, степень упорядоченности взаимосвязанных тропоколлагеновых и микрофибриллярных комплексов [295, 405]. Предложенная впервые методика основана на оценке механической жёсткости коллагенового волокна и изучения степени его разрешённости поперечной D-исчерченности [218, 219]. Для этого образцы биологического материала (биоимлантат с нанодисперсной плацентой, биоимплантат с крупнодисперсной плацентой, глазное яблоко животного) фиксировали в 10 % нейтральном формалине и заливали в парафин. Изготовленные на микротоме парафиновые срезы помещались на поверхность предметного стекла с последующей химической очисткой от парафина с помощью ксилола. Депарафиновые срезы изучались АСМ-методом в прерывисто-контактном режиме в воздушной среде с определением механической жёсткости коллагенового волокна и степени разрешённости поперечной D-исчерченности. При изучении биологического материала по предложенному способу участки соединительной ткани исследовались с помощью сканирующего зондового микроскопа в методе измерения рельефа, при котором изображение формировалось на основе изменения положения кантилевера (гибкой консоли с зондом) при взаимодействии с поверхностью и отражало топографические особенности образца. Кроме этого, исследование производилось и в методе фазового контраста, при котором изображение формировалось на основе регистрации сдвига фазы колебаний кантилевера при взаимодействии с поверхностью в процессе сканирования и отражало как топографичекие особенности, так и изменение упругих характеристик поверхности исследуемого образца, что позволяло выявить характерную структуру коллагеновых фибрилл (поперечную исчерченность) и отличия в жёсткости отдельных коллагеновых волокон. С целью установки степени поперечной разрешённости оценивалась высота шага между щелью и зоной перекрытия отдельных фибрилл c помощью Фурье-анализа (Image Analysis 3, НТ-МДТ, Россия) из анализа профилей поперек и вдоль оси фибрилл на топографических изображениях, предварительно обработанных нелинейным фильтром высоких частот с помощью программы Image Analysis 3 (НТ-МДТ, Россия). Аналогично оценивались диаметр коллагеновых структур и период их исчерченности (D–размер). При этом учитывалось, что количество ковалентных сшивок между молекулами тропоколлагена для новообразованной ткани меньше, чем в зрелой, что сопровождалось низкой жёсткостью новообразованных фибрилл и малой высотой шага между щелью и зоной перекрытия, по сравнению со зрелыми. В свою очередь, жёсткость коллагеновых волокон оценивалась изменением сдвига фазы опорных колебаний кантилевера (изменение фазового контраста). На метод оценки степени зрелости коллагенового волокна – «Способ оценки зрелости коллагеновых волокон» получен Патент РФ № 2446398 (приоритет от 18.05.2009 г.).
Для изучения глубины проникновения в ткани реципиента были получены флуоресцентные спектры от нанодисперсной плаценты и тканей реципиента, в частности, склеры, и оценивалось нахождение частиц нанодисперсной плаценты в тканях реципиента методом наложения спектров друг на друга. Спектроскопический флуоресцентный анализ гистологических срезов по точкам был выполнен на сканирующей зондовой лаборатории ИНТЕГРА Спектра (НТ-МДТ, Россия). В данном случае прибор использовался для конфокального оптического исследования образца, с возможностью двумерного сканирования отдельных участков в выбранном спектральном диапазоне и анализа спектральной картины в контрольных точках. Все спектры получены на воздухе при комнатной температуре из области фокуса лазера с участков около 400 нм. Использовался твердотельный лазер с непрерывным источником электромагнитного излучения на длине волны 473 нм и гелий неоновый лазер на длине волны 632.8 нм. Распределение химического состава по образцу проводилось выбором отдельных участков спектральной картины, полученной на ПЗС (прибор с зарядовой связью) детекторе, и анализировалось путём дальнейшего двумерного сканирования в выбранной области образца. Характерное время накопления сигнала спектральной картины для каждой контрольной точки – 10 с. Размеры структурных фрагментов были оценены из анализа АСМ-изображений, предварительно обработанных самосогласованным ранговым фильтром высоких частот и фильтром для устранения межстрочных скачков с помощью программы Image Analysis 3 (НТ-МДТ, Россия).
2.3.3 Методы исследования регенеративной активности соединительнотканных структур глаза животного
Во второй серии основного этапа экспериментального исследования производилась оценка степени регенеративной активности соединительнотканных структур глаза в зоне имплантации биоимплантата с нанодисперсной плацентой (митотическая и апоптотическая активность клеток соединительной ткани глаза животного).
Проводили экспериментальные исследования на крысах (4 группы животных по аналогии с кроликами, n = 80). Первая опытная группа (n = 20) – имплантация биоимплантата с нанодисперсной плацентой под конъюнктиву на склеру глаза крысы под общей анестезией (Рисунок 6). В роли анестезирующего препарата применялся Золетил в дозе 0,1 мл внутримышечно. Вторая опытная группа (n = 20) – аналогичная имплантация изделия с крупнодисперсной плацентой. При этом размеры биоимплантата с нанодисперсной и крупнодисперсной плацентой в обеих опытных группах были (3,0 ± 0,5) × (1,0 ± 0,2) мм (Рисунок 5). Первая контрольная группа (n = 20) – имплантация изделия без предварительного заполнения биологическим материалом. Вторая контрольная группа (n = 20) – ложнооперированные. Морфологические исследования производили через 3, 7, 30 и 60 суток после манипуляций.
Сроки экспериментального исследования определялись видовыми особенностями исследуемых животных, в частности, согласно данным, при продолжительности жизни крыс, равной 2,5-3 годам, период, ограниченный 60 сутками, соответствует 102-104 месяцам (8,5-8,6 лет) жизни человека [48]. Следовательно полученные ответы позволяли судить о возможных отдаленных реакциях реципиента на введение биоимплантата.
Срезы изучали под микроскопом Leica DM 2500 с камерой DFC 450 при х50, х100, х200, х400 кратном увеличении с последующим фотографированием. При этом пролиферативную активность тканей глаза крысы изучали выявлением негистонного белка Ki-67, который, как правило, определяется в ядрах делящихся клеток во время поздней G-фазы, S, G2 и M-фазы клеточного цикла и является маркёром пролиферации клетки [175, 303, 354, 355]. Индекс пролиферации высчитывался как процентное отношение количества пролиферирующих клеток (Ki-67+ клетки) к общему количеству клеток соединительной ткани глаза крысы в поле зрения равном 0,01 мм² [137].
Апоптотическую активность тканей глаза крысы оценивали выявлением активности проапоптозного белка каспазы-3, так как именно на нём сходятся различные пути апоптотической гибели, и его активация указывает на индукцию апоптоза [4, 13, 279, 325, 347, 361]. Индекс апоптотической активности рассчитывался как процентное отношение количества клеток, находящихся в состоянии апоптоза, к 100 клеткам соединительной ткани глаза крысы.
Иммуногистохимическое выявление антигенов в образцах тканей глаза у крыс проводили непрямым иммунопероксидазным методом на парафиновых срезах тканей, фиксированных в формалине. При этом набранный материал фиксировали в течение суток в забуференном формалине (1:10, рН 7,4), промывали, обезвоживали и заливали в парафиновую среду «Histomix», после чего изготавливали срезы толщиной 5 мкм и монтировали на предметные стекла с поли-L-лизиновым покрытием. В работе использовали концентрированные кроличьи моноклональные антитела к белку Ki-67 производства Spring bioscience (clone sp6), разведённые дилюентом в пропорции 1:50 (разведение определяли экспериментальным путём), а также готовые к использованию кроличьи поликлональные антитела к белку Caspase-3 производства DCS Innovative Diagnostik-Systeme. Для визуализации использовали компоненты системы детекции «REVEAL Polyvalent HPR-DAB Detection System» производства Spring Bioscience по протоколу, рекомендованному производителем. При этом последовательно депарафинировали и регидратировали срезы, инкубировали 10 минут в “Hydrogen Repoxide Block”, отмывали в фосфатном буферном растворе (PBS), после чего проводили демаскировку антигенов путём 10-минутного кипячения образцов в микроволновой печи в среде цитратного буфера с рН 6,0. Затем отмывали в PBS, инкубировали 10 минут в «Protein Block», отмывали в PBS и наносили рабочие растворы первичных антител, которые выдерживали на срезах 30 минут при комнатной температуре во влажной камере. После трёхкратной отмывки в PBS наносили на срезы «HRP conjugate», инкубировали 15 минут при комнатной температуре, 4 раза отмывали в PBS и наносили на 10 минут хромоген (смесь «DAB Chromogen» и «DAB Substrate»в пропорции 1:50). Затем отмывали в PBS и проводили докрашивание образцов гематоксилином, после чего производили обезвоживание и заключение в «Bio mount».
2.3.4 Биомеханические методы исследования
В третьей серии основного этапа экспериментального исследования производилась оценка биомеханических характеристик склеры опытных животных при введении биоимплантата с нанодисперсной плацентой эпибульбарно. Для биомеханического тестирования применялись методы исследования изолированной склеры кролика (n = 36). Для этого изучалась склера из каждой группы животных исследуемых в первой серии основного этапа работы. Забиралась для исследования склера глаза животных из первой опытной группы с введением биоимплантата с нанодисперсной плацентой (n = 9), из второй опытной группы – с введением биоимплантата с крупнодисперсной плацентой (n = 9), из первой контрольной группы – с введением фрагмента отрезка пуповины (n = 9), из второй контрольной группы – ложнооперированных животных (n = 9). Исследования проводились на 30, 60 и 90-е сутки после хирургической манипуляции.
Для биомеханического тестирования применялись методы исследования изолированной склеры кролика. Биомеханические испытания образцов склеральной ткани проводили в режиме однократного нагружения с целью получения таких показателей, как предел прочности (ПП) и модуля Юнга (МЮ).
Испытания производили следующим образом: отпрепарированная склера глаза кролика тщательно очищалась от окружающих тканей и с помощью микрохирургического лезвия вырезались образцы склеры стандартной ширины 5 мм в меридиане введения биоимплантата эпибульбарно. Учитывая неоднородность склеральной ткани, толщину h каждого из подготовленных образцов измеряли с помощью электронного цифрового толщиномера L1H, (точность измерений ± 0,001 мм) в трёх точках, после чего определяли среднюю величину, которую использовали в дальнейших расчётах. Отклонение от этого значения в пределах одного образца не превышало обычно ± 0,02 мм. Для транспортировки фрагментов склеры в лабораторию для биомеханических испытаний использовалась среда Борзенка-Мороз для хранения роговицы.
Исследования проводили на универсальной высокоточной испытательной машине Инстрон-3322 в лаборатории прочности и пластичности металлических и композиционных материалов и наноматериалов № 10 ФГБУ ИМЕТ РАН им. А.А. Байкова. Испытательная машина Инстрон-3322 снабжена блоком автоматической записи эксперимента на мониторе (записывается кривая зависимости удлинения образца от величины нагрузки), а также самозатягивающимися зажимами, исключающими возможность неправильного положения или выскальзывания исследуемых образцов во время испытания. Для работы в режиме одноосного нагружения вплоть до разрыва для образцов склеры глаза кролика устанавливали тензиометрический датчик на 20 Н. Использовали постоянную скорость нагружения 1 мм/мин. Исходя из записанной кривой на мониторе искомые биомеханические показатели вычислялись автоматически.
После проведения биомеханических испытаний склеральная ткань погружалась в 10 % раствор нейтрального формалина. Затем через сутки фиксации промывали проточной водой, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Полученные гистологические срезы подвергались химической депарафинизации и в полуконтакном режиме на воздухе изучались на сканирующей зондовой лаборатории ИНТЕГРА Прима (НТ-МДТ, Россия).
Распределение экспериментального материала по количеству объектов и основных методов, применённых при исследовании, представлено в Таблице 2 и Таблице 3.
2.3.5 Статистические методы исследования
Статистическую обработку полученных данных в ходе экспериментальных исследований проводили методами анализа малых выборок [3]. Формирование репрезентативной выборки производили с помощью серийного (гнездового) отбора.
Статистическую обработку материалов производили с использованием компьютерных программ Microsoft Excel 2007 и БИОСТАТИСТИКА для Windows и DOS IBM-PC. При статистической обработке полученных данных для каждого показателя производили расчёт средней арифметической – M (Mean), среднего квадратического отклонения σ (Standard Deviation) и ошибки средней (m). Для сравнения средних и оценки достоверсностей различий использовали t-критерий Стьюдента (t-test for independent samples), U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни (Mann –Whitney U-test) для оценки различий независимых совокупностей [227].
Критический уровень статистической значимости при проверке нулевой гипотизы принимали равным 0,05. Сравнение показателей проводилось с определением уровня значимости p (P-value), при этом различия считались достоверными при p ≤ 0,05.
