Обсуждение результатов и заключение

    Преимущества селективной эндотелиальной кератопластики над сквозной на данном этапе развития офтальмохирургии не вызывают сомнений. Проведение операции в условиях «закрытого неба» существенно снижает риск развития опасных интраоперационных осложнений. Кроме того, отсутствие обширного сквозного рубца и полное сохранение стромы позволяет сохранить биомеханическую устойчивость роговицы к травме, иннервацию и трофику роговицы реципиента, минимизировать индуцированный астигматизм [109, 129]. В целом это способствует сокращению срока клинической и зрительной реабилитации больных после трансплантации ультратонкого лоскута роговицы.

    Задняя автоматизированная послойная кератопластика (ЗАПК) в настоящее время является наиболее часто используемым хирургическим методом реабилитации больных с эндотелиальной дистрофией роговицы различного генеза и буллезной кератопатией в развитых странах. Однако до сих пор в стадии разработки остается вопрос повышения клинико-функциональных результатов ЗАПК путем использования трансплантатов задних слоев донорской роговицы с минимальной толщиной остаточной стромы. На сегодня существует несколько методик получения ультратонкого трансплантата задних слоев роговицы, включающих в себя технику двойного реза микрокератомом, использование фемтолазера. Особняком, по нашему мнению, стоит техника предварительной дегидратации донорской роговицы путем ее помещения в специальную среду. По нашим данным и данным литературы, применение техники двойного реза микрокератома способствует получению более равномерного трансплантата толщиной около 100 мкм [137]. Однако она имеет высокий риск перфорации донорской роговицы. Кроме того, в сравнительных исследованиях было показано, что отношение нежизнеспособных клеток эндотелия донорской роговицы к общему количеству эндотелиальных клеток в группе двойного реза составляло 0,0145, а в группе с одним резом - 0,0028. Таким образом, проведение дополнительного реза донорской роговицы приводит к статистически значимому более высокому количеству поврежденных нежизнеспособных эндотелиальных клеток [136]. Применение лазеров (преимущественно фемтосекундных) для выкраивания трансплантата задних слоев роговицы приобретает все большую популярность ввиду простоты методики и возможности получения равномерного трансплантата заданной толщины. Однако, по данным литературы, фемтолазерное сопровождение характеризуется более высокой потерей эндотелиальных клеток по сравнению с применением микрокератома [135]. Также стоит отметить, что применение фемтосекундного лазера приводит к коллатеральным повреждениям и вторичному индуцированному излучению, приводящему к патологическому накоплению перекисных радикалов в тканях. Эти радикалы оказывают повреждающее действие на клеточные и тканевые структуры стромы роговицы, что может провоцировать избыточную асептическую воспалительную регенерацию в посттрансплантационном периоде [94]. Другим направлением получения ультратонких трансплантатов, которое в настоящее время только получает свое развитие, является предварительная дегидратация донорской роговицы непосредственно перед выкраиванием. Однако, согласно литературным данным, эта методика не получила своего развития в связи с дополнительными манипуляциями: переносом донорской роговицы в отдельную ёмкость со специальным раствором и повышенным риском контаминации донорского материала [94]. Среди методов, направленных на получение ультратонкого трансплантата задних слоев роговицы также можно выделить технологию, заключающуюся в истончении роговицы потоком стерильного воздуха. В проведенном исследовании было показано, что предложенная методика способствует достижению толщины роговицы равной 530 мкм. Однако указанная технология представляется трудоемкой и, по мнению ее разработчиков, требует дальнейшего изучения [127].

    Необходимо отметить, что до настоящего времени нет ни одной публикации, в которой отражалось бы изучение апоптоза повреждений хромосом в кератоцитах и эндотелии донорских роговиц, подвергнутых предварительной дегидратации в различных растворах перед выкраиванием с помощью методов механический микрокератотомии и фемтолазерного сопровождения. Такие исследования представляют несомненный научный и практический интерес.

    С учетом вышесказанного целью работы явилась разработка алгоритма предоперационной подготовки заднего послойного трансплантата роговицы на основе собственной рецептуры консервационной среды для оптимальной дегидратации донорской роговицы и техники выкраивания ультратонкого лоскута оптимизированным методом одинарного прохода микрокератомом в условиях Глазного тканевого банка.

    Для достижения поставленной цели работа была разделена на 5 этапов соответствующих задачам исследования, которое включало в себя разработку рецептуры консервационной среды для оптимальной дегидратации донорской роговицы и обоснование ее физико-химических свойств, изучение морфо-функциональных характеристик культуры кератоцитов и эндотелиальных клеток роговицы, культивируемых в разработанной среде, проведение морфометрических исследований стабильности и плотности эндотелиальных клеток донорских роговиц после консервации в разработанной среде, поиск оптимального метода выкраивания ультратонкого трансплантата роговицы, консервированного в предложенной среде, техникой одинарного прохода микрокератомом и исследования жизнеспособности эндотелиальных клеток ультратонких трансплантатов роговицы, а также разработка пошагового

    Алгоритма предоперационной подготовки заднего послойного трансплантата роговицы в условиях Глазного тканевого банка.

    На первом этапе было проведено обоснование физико-химического состава предложенной среды.

    Как известно из приведенной литературы в первой главе настоящей работы, одним из основополагающих направлений в развитии новых консервационных сред для гипотермического хранения роговицы является сохранение жизнеспособности и морфофункциональной сохранности ЭК трансплантатов донорских роговиц, путем повышения их резистентности к гипотермическому стрессу, фактору длительной изоляции и торможении процессов посмертного апоптоза. Так, в работе по применению препарата NeyDIL Nr.37 «Cornea» в составе базисного раствора для хранения роговицы (ТУ № 9398-013-29039336-2008 (пропись среды Борзенка-Мороз) показано повышение жизнеспособности и сохранение цитоархитектоники эндотелиальных клеток донорских роговиц, но без достижения дегидратирующего эффекта и нормализации толщины стромы [4]. Помимо этого, установлено, что препарат NeyDIL Nr.37 не восстанавливает липидный слой клеток роговицы, повреждение которого, как известно, является причиной внутриклеточного некроза как эндотелия, так и кератоцитов.

    Согласно проведенному нами глубокому поиску литературных источников, до настоящего времени нет ни одной работы, посвященной разработке рецептуры специализированной среды для гипотермической консервации и предварительной дегидратации донорской роговицы перед выкраиванием ультратонких задних послойных трансплантатов.

    Предложенная нами рецептура оригинальной среды содержит разрешенный к применению фармакологический препарат Фосфоглив - комбинированное мембранопротективное и мембраностабилизирующее средство. Препарат способен восстанавливать клеточные и внутриклеточные мембраны, их структуру и функции при повреждении, тем самым оказывать цитопротекторный эффект, нормализовывать белковый и липидный обмены, даже в условиях гипотермии.

    Помимо этого, данная среда собственной рецептуры содержит онкотический агент Декстран-40 ( мол. масса 40.000 D) в умеренно повышенной концентрации (6,0 – 7,0 %) в отличие от стандартной концентрации 5,0 % в контрольной среде Борзенка-Мороз, посредством чего достигается дегидратирующий эффект посмертно набухшей донорской роговицы.

    Проведенное исследование физико-химических свойств предложенной нами среды показало, что она имеет оптимальный для эндотелиальных клеток pH (7,4±0,01), при этом показатель осмолярности статистически выше, чем в среде Борзенка-Мороз (326±0,9 мосм/л и 323±0,8 мосм/л соответственно), что обусловлено большей концентрацией онкотического агента, чем и объясняется дегидратирующий эффект предложенной прописи. При этом важно отметить, что, несмотря на умеренно завышенные показатели значений, осмолярность предложенной среды не входила за рамки референсных значений осмолярности влаги передней камеры.

    В литературе имеются данные по изучению недавно предложенной среды для дополнительной дегидратации, после стандартной гипотермической консервации, донорских роговиц – «Thin – C medium» (Alchimia, Italy) [52]. Данная среда в своем составе содержит комбинацию декстранов разной молекулярной массы T500, T40, имеет pH 7,2–7,4 при осмоляльности 300–360 мосм/кг. Проведенное экспериментальное исследование показало возможность получения трансплантата задних слоев роговицы с более гладким интерфейсом, однако, по мнению авторов, проблема непрогнозируемого реза микрокератома и риск получения перфорации донорского материала остаются по-прежнему крайне актуальными. Кроме того, предложенная рецептура среды не содержит в своем составе мембранопротекторных компонентов, повышающих устойчивость эндотелиальных клеток роговицы к стрессовому воздействию, в том числе на интраоперационную травму в процессе выкраивания заднего послойного трансплантата.

    В нашей работе для оценки дегидратирующих свойств предложенной среды была изучена толщина и масса донорских роговиц (n=8), консервированных в указанной среде и растворе для хранения роговицы (среда Борзенка-Мороз), соответственно, в опыте и контроле. Установлено, что консервация в предложенной среде на 1-е сутки приводит к уменьшению толщины на 19% с постепенным увеличением и достижением номинальной величины (масса 0,195±0,015 г; толщина 648±35 мкм) к 3-м суткам; в контрольной группе дегидратация с первых суток практически не наблюдалась. Начиная с 3-х суток, гидратация в опытной группе достигала номинальных значений с тенденцией к стабилизации, поэтому дальнейшее наблюдение не производилось.

    Дальнейшим направлением наших исследований являлось изучение безопасности среды собственной рецептуры на культурах клеток кератоцитов и эндотелия донорских роговиц. С этой целью проводили исследования морфофункциональных особенностей указанных клеточных культур на пролиферативную активность кератоцитов, апоптоз (в культуре кератоцитов) и оценку жизнеспособности эндотелиальных клеток. Установлено, что культура кератоцитов в обеих группах сохраняла свой уникальный фенотип с выраженной экспрессией характерных маркеров кератоцитов (люмикана и кератокана) при отсутствии экспрессии α-гладкомышечный актина. Оценка жизнеспособности культуры кератоцитов в опыте и контроле была сопоставима, при этом экспрессия маркеров раннего аппоптоза каспазного пути – каспаза 3 и 8, а также митохондриального пути – цитохром С и BAX отсутствовали.

    Пролиферативная активность клеток в обеих группах также была сопоставимой, что свидетельствовало об отсутствии у предложенного состава среды стимуляционной и трансформационной активности.

    При оценке влияния разрабатываемой среды на культуру эндотелиальных клеток роговицы было выявлено, что на протяжении 7 дней культивирования в обеих группах происходит постепенная незначительная потеря их жизнеспособности. Однако достоверная разница между группами отсутствовала и не превышала 8-ми %. Иммуногистохимическое исследование выявило сохранность морфофункциональных особенностей эндотелиальных клеток в обеих группах, а именно наличие экспрессии маркера помпальной функции – Na/K АТФазы и маркера плотных межклеточных контактов – ZO-1.

    На третьем этапе осуществлялась консервация донорских роговиц с высоким показателем трансплантабельности 3А (n=24) в предложенной среде собственной рецептуры (опытная группа) и в базисном растворе для хранения роговицы (контрольная группа) [3] с целью изучения особенностей ультраструктуры, плотности и жизнеспособности эндотелиальных клеток непосредственно на донорских роговицах на протяжении 9-ти суток.

    Для оценки состояния клеточных мембран и органелл использовалась трансмиссионная электронная микроскопия на электронном микроскопе JEM 1200 EX II, Япония. Проведенное исследование показало, что уже на 1-ые сутки эксперимента в опытной группе наблюдалось уплотнение наружных клеточных и внутриклеточных мембран с усилением эффекта на 2-ые сутки и сохранностью до 6-ых суток консервации. При этом в контрольной группе наблюдалось постепенное истончение и повреждение клеточных мембран начиная с 5-ых суток: выявлены грубые ультраструктурные изменения с дегенерацией органелл..

    При анализе потери эндотелиальных клеток в связи с развитием апоптоза обнаружено, что количество поврежденных клеток увеличивалось постепенно и к 9-ти суткам консервации в опытной группе достигло всего 2,5 %, в контрольной группе – 4,3 %.

    В результате проведенных исследований было показано, что среда предложенной рецептуры является биологически безопасной, способствует дегидратации стромы донорских роговиц, сохранению ультраструктуры эндотелиальных клеток вплоть до 9-ти суток и проявляет антиапоптотическое действие.

    Полученные результаты позволили перейти к следующему этапу исследования, а именно к разработке технологии (как части пошагового алгоритма) получения заднего послойного ультратонкого трансплантата методом однарного реза микрокератома доноских роговиц, предварительно консервированных в среде собственной рецептуры с дегидратирующими и мембраностабилизирующими свойствами.

    В результате проведенных исследований на этом этапе было установлено, что в опытной группе за счет большей дегидратации донорских роговиц одинарный проход режущей головкой позволяет формировать (статистически достоверно, p<0,05) ультратонкие задние послойные трансплантаты (105,3±14,2 мкм) по сравнению с группой контроля (163,6±10,7 мкм). Результаты сканирующей электронной микроскопии сформированных ультратонких трансплантатов продемонстрировали сохранность архитектоники и картину умеренной дегидратации коллагеновых волокон стромы донорских роговиц, консервированных в предложенной среде по сравнению с аналогичными образцами из группы контроля. Изучение морфофункциональной сохранности эндотелиальных клеток ультратонкого трансплантата роговицы не выявило достоверной разницы с контрольной группой, что исключает токсический и повреждающий эффект консервационной среды собственной рецептуры.

    В результате проведенных фундаментальных исследований нами впервые был разработан и предложен к практическому применению пошаговый Алгоритм предоперационной подготовки заднего послойного трансплантата роговицы в условиях Глазного тканевого банка с использованием консервационной среды собственной рецептуры с дегидратационными и мембраностабилизирующими свойствами и техники одинарного прохода механическим кератомом.