Оптимизация технологии передней глубокой послойной кератопластики

     Для оптимизации технологии передней глубокой послойной кератопластики в серии экспериментов ex vivo моделировали отслойку Десцеметовой мембраны, индуцированную в ходе ее сепарации от стромы роговицы с помощью физиологического раствора (I группа исследования), вискоэластика (II группа исследования), воздуха (III группа исследования) и последовательного сочетанного введения воздуха и вискоэластика (IV группа исследования).

    Экспериментальные исследования проводили на изолированных донорских (кадаверных) глазах (n=20), при этом каждую методику сепарации ДМ проводили на равном количестве глаз (n=5).

    Ход эксперимента заключался в следующем. Кадаверные глаза устанавливали в фиксатор глазного яблока, после чего проводили деэпителизацию роговицы и маркером отмечали ее центр. Затем вакуумным трепаном Barron (Katena, USA) диаметром 8,0 мм производили несквозное трепанирование роговицы на не менее половины ее толщины. Далее расслаивателем отделяли поверхностные слои стромы роговицы от глубоких. В оставшейся части стромы роговицы металлическим лезвием производили разрез длиной 1 мм, стремясь по глубине максимально приблизиться к ДМ. С помощью тупого шпателя из дна разреза по направлению к центру роговицы формировали интрастромальный тоннель длиной 3-4 мм. В тоннель вводили тупоконечную канюлю с отверстием, обращённым в сторону ДМ, через которую подавали физиологический раствор (I группа), вискоэластик (II группа), воздух (III группа) либо последовательно воздух, а затем – вискоэластик (IV группа) для формирования «большого пузыря», отделяющего ДМ от глубоких слоев стромы. Далее проводили оптическую когерентную томографию всех кадаверных глаз на аппарате OCT Visante (Carl Zeiss, Германия) в режиме «High Res. Cornea». На снимках оценивали наличие либо отсутствие отслойки ДМ.

    На втором этапе исследования на тех же глазах моделировали этап обнажения ДМ. При этом в случаях наличия «большого пузыря», после проведения металлическим лезвием крестообразные надрезов, круглыми ножницами Ваннас удаляли глубокие слои стромы до обнажения ДМ. В глазах, где не произошло формирование «большого пузыря» обнажение ДМ проводили методом механической сепарации тупоконечным расслаивателем с последующим иссечением стромы до ДМ.

     Результаты ОКТ свидетельствовали о достижении отслойки ДМ в 2-х случаях из 5-и во II группе и во всех случаях - в III и IV группах, в то время как при использовании физ. раствора в качестве расслаивателя (I группа исследования) ни в одном случае не было достигнуто формирования «большого пузыря».

    При моделировании методики ПГПКП на кадаверных глазах после предварительной отслойки ДМ (либо попытки ее отслойки) различными методами, описанными в предыдущем исследовании, получили следующие результаты.

    В I группе исследования удалось обнажить ДМ без ее перфорации в 1-м случае из 5-и. При этом во всех случаях обнажение ДМ проходило механическим путем. Во II группе ДМ была обнажена без ее перфорации в 3-х случаях из 5-и, при этом в 2-х случаях – методом вскрытия «большого пузыря» а в 1-м случае – механическим путем. В III группе ДМ была обнажена без перфорации в 4-х случаях из 5-и, при этом в 3-х случаях – методом вскрытия «большого пузыря», а в 1-м случае – механическим путем. В IV группе ДМ была обнажена без перфорации во всех случаях методом вскрытия «большого пузыря».

    На заключительном этапе исследования на 20-и изолированных донорских глазах проводили морфологическое исследование. Для этого материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, промывали проточной водой, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Выполняли серии гистологических срезов с применением окраски гематоксилин-эозином. Препараты изучали под микроскопом фирмы Leica DMLВ2 (Германия) при х50, х100, х200, х400 кратном увеличении с последующим фотографированием.

     В результате, в I группе исследования при использовании физиологического раствора для расслаивания роговицы, ни в одном случае не достигли полного освобождения ДМ от стромальных элементов. При этом отметили разволокнение и обводнение стромы, вследствие свободного распределения жидкости между волокнами (Рис. 6). Данный факт не позволял четко контролировать глубину трепанации, что приводило к перфорации в 4-х случаях из 5-и (Рис. 7).

    Во II группе расслоение вискоэластиком привело к его равномерному распределению между стромальными волокнами, что увеличило объем роговицы, но при этом придало ей упруго-эластичные свойства. При микроскопии строма приобретала ячеистый вид с множеством овальных микрополостей (микрокавитации) с тонкими перемычками, состоящих из стромальных волокон (Рис. 8). Учитывая, что введение вискоэластика в основном было направлено к задним слоям стромы, именно в этом отделе наблюдали появление сливных микрополостей (Рис. 9Б). При этом на поверхности ДМ оставалось минимальное количество стромы (Рис.9).

    В III группе при расслоении роговицы воздухом наблюдали его частичное просачивание между стромальными волокнами, что проявлялось в виде более редких микрополостей в средних слоях стромы с чередованием участков сохранения ее структурности. При этом сохранение остаточной стромы отмечали в участках, где воздух минимально инфильтрировал слои роговицы (Рис. 10). Однако все это сопровождалось полным отстоянием ДМ, на поверхности которой отмечали участки с различным количеством остаточной стромы (Рис. 11) от значительного (Рис. 11Б) до полного ее освобождения (Рис. 11Г). Толщина остаточной стромы в участках ее максимального сохранения трёхкратно превышала толщину интактной ДМ (Рис. 11Б). Вероятно, это связано с неравномерным распределением воздуха в строме. При данной методике расслоения в 2-х из 5-и случаев также обнаруживали фрагменты перфорации ДМ (Рис. 12). Однако их количество было значительно меньше, чем в I группе (в 4-х из 5 случаев).

    В IV группе методика последовательного введения воздуха и вискоэластика привела к полному отслоению ДМ (Рис. 13). При этом отслоенный комплекс был представлен только ДМ (Рис. 14 В). Лишь в центральной зоне встречались участки, где в отслоенный комплекс входила часть стромальных волокон (Рис. 14Б) при наличии гладкой задней поверхности отслоенной стромы роговицы. Перфораций выявлено не было (Рис. 14А).

     Результаты морфологических исследований подтвердили, что все вышеозначенные способы сепарации ДМ в той или иной степени эффективны. Отмечавшиеся различия касались количества остаточной стромы и степени травматизации ДМ во время резекции поверхностных и глубоких слоев стромы, что приводило к нарушению ее целостности. При этом наиболее результативными методиками сепарации ДМ от стромы роговицы по результатам эксперимента оказались использование воздуха и сочетанного последовательного введения воздуха и вискоэластика. Из них лишь при последовательном сочетанном способе сепарации ДМ не выявили ни одного случая ее перфорации, что подтверждает его наименьшую травматичность, обусловленную протекторным действием вискоэластика в момент резекции стромы.

    Таким образом, представленные в данной главе результаты, включают целый спектр различных технологических разработок и экспериментальных исследований, направленных на оптимизацию современных методов хирургического лечения прогрессирующих кератэктазий: интрастромальную кератопластику с имплантацией роговичных сегментов, УФ-кросслинкинг и переднюю глубокую послойную кератопластику.

    Так, на этапах оптимизации техники ИСКП разработали градуированное вакуумное кольцо, способное, благодаря своим конструктивным особенностям значительно повысить качество технических условий выполнения каждого этапа данного оперативного вмешательства, начиная с разметки оптических зон и заканчивая имплантацией сегментов.

    На этапах оптимизации дозированного УФ-кросслинкинга разработали специальный скарификатор, позволяющий проводить дозированную деэпителизацию роговицы без опасности повреждения передних слоев ее стромы. Кроме того, для определения проникновения рибофлавина в строму роговицы впервые применили метод инфракрасной Фурье-спектроскопии, благодаря которому установили, что при полной и дозированной деэпителизации роговицы происходит пропитывание всей толщины ее стромы рибофлавином, чье нахождение в роговице в достаточном объеме необходимо для проведения УФ-кросслинкинга. При этом выявили несостоятельность трансэпителиального варианта выполнения вмешательства, при котором не происходит проникновения рибофлавина в строму роговицы. Помимо этого, доказали преимущество дозированного УФ-кросслинкинга, в сравнении с его классической методикой, по скорости восстановления целостности эпителия роговицы.

     На этапах оптимизации передней глубокой послойной кератопластики провели моделирование и определение оптимальных параметров формирования отслойки ДМ, индуцированной в ходе различных методов ее сепарации: с помощью физиологического раствора, вискоэластика, воздуха и сочетанным последовательным введением воздуха и вискоэластика. При этом, по результатам морфологических исследований, проведенных с позиций структурных особенностей остаточной стромы роговицы, толщины и чистоты обнаженной ДМ, определили, что наиболее эффективной методикой сепарации ДМ в ходе выполнения ПГПКП является сочетанное последовательное введение воздуха и вискоэластика – аэро-вискосепарация.

    Результаты использования в клинике разработанных и описанных выше авторских разработок, подтвержденных в ходе экспериментальных исследований, представлены в следующих главах настоящей диссертационной работы.