Рис. 3. Инструмент для дозированной скарификации эпителия роговицы: 1 - корпус, 2 - закрытый торец, 3 - сквозное центральное отверстие, 4 - фланец, 5 - рабочая часть, 6 - основание рабочей части 7 - боковая цилиндрическая поверхность, 8 - рабочая поверхность рабочей части, 9 - кнопка, 10 - шток, 11 - пружина, 12 – шипы (микроиглы)
Рис. 4. ОКТ роговичного эпителия пациента С. до (А) и после (Б) трехкратной инстилляции 0,5% раствора проксиметакаина. Отмечается значительное увеличение центральной толщины эпителия роговицы после применения раствора анестетика
На первом этапе мы сочли целесообразным создать новый инструмент для проведения дозированной скарификации эпителия роговицы, обладающего, во-первых, рабочей поверхностью, повторяющей форму роговицы, во-вторых, способностью к самоцентрации и, в-третьих, позволяющего одним движением, не затрагивая передние слои стромы, проводить ее равномерную, дозированную деэпителизацию.
Разработанный инструмент для дозированной скарификации эпителия роговицы (заявка на патент № 2013130332 от 04.07.2013 г., положительное решение о выдаче патента от 02.07.2014 г.) состоит из полого цилиндрического корпуса, один торец которого отрыт, а в закрытом торце имеется сквозное центральное отверстие с фланцем. Рабочая часть расположена внутри корпуса и состоит из основания, боковой цилиндрической и рабочей поверхности. При этом основание и боковая цилиндрическая поверхность рабочей части конгруэнтны внутренней поверхности корпуса, а основание рабочей части в центре жестко соединено с кнопкой посредством штока с пружиной, проходящего через отверстие корпуса. Это дает возможность осуществлять возвратно-поступательные движения по отношению к корпусу. При этом пружина располагается вокруг штока между кнопкой и закрытым торцом корпуса, рабочая поверхность рабочей части, выполненная вогнутой по кривизне роговицы, обращена к открытому торцу корпуса, а 90 шипов (микроигл), расположенных на рабочей поверхности рабочей части в количестве 25 шипов на см², имеют длину 60 мкм (Рис. 3).
С целью определения необходимой длины микроигл скарификатора для выполнения дозированной деэпителизации роговицы было проведено исследование толщины эпителия роговицы 30 глаз 19-ти пациентов с I-III стадиями кератоконуса до и после закапывания раствора анестетика, применяемого на этапе подготовки (премедикации) к УФ-кросслинкингу. В каждом случае толщину эпителия измеряли дважды: до и после трехкратной инстилляции по 1-й капле 0,5% раствора проксиметакаина с интервалом 2 минуты. Регистрацию толщины корнеального эпителия проводили на приборе CIRRUS HD-OCT.
Полученные результаты свидетельствовали о том, что средняя толщина эпителия в центре роговицы до инстилляции раствора анестетика составила 46,9+1,2 мкм, после трехкратной инстилляции 0,5% раствора проксиметакаина данный показатель оказался достоверно выше (p<0,01), составив 55,3+1,3 мкм (Рис. 4).
Аналогичные расчеты провели для толщины эпителия в 3-х миллиметрах от центра роговицы. В данной зоне средняя толщина эпителия до инстилляции раствора анестетика составила 56,2+1,2 мкм. После трехкратной инстилляции 0,5% раствора проксиметакаина данный показатель также достоверно увеличился (p<0,01) и составил 60,3+1,4 мкм.
Таким образом, результаты расчетов свидетельствовали об увеличении толщины эпителия в центре роговицы после использования раствора анестетика до 55,3+1,3 мкм, что указывало на достаточную длину микроигл в разработанном скарификаторе 60 мкм для проведения УФ – кросслинкинга без повреждения передних слоев стромы роговицы.
Для исследования глубины и характера повреждения роговицы при использовании разработанного инструмента скарификатора были проведены экспериментальные исследования ex vivo с использованием 3-х кадаверных глаз. В ходе эксперимента их закрепляли в специальном держателе и затягивали его крепление таким образом, чтобы тонус кадаверных глаз соответствовал таковому у живого человека. Далее на глаз устанавливали разработанный скарификатор для дозированной деэпителизации, нажимали на его кнопку и слегка ротировали в нажатом положении (в пределах 5-10°). После этого глаз фиксировали в растворе формалина. Материал исследования подвергали стандартной гистологической обработке с подготовкой серии срезов с применением окраски гематоксилин-эозином. Препараты изучали под микроскопом фирмы Leica DM LB2 (Германия) при увеличении х50, х100, х200, х400 крат с последующей фоторегистрацией.
Результаты морфологических исследований свидетельствовали о нарушении целостности эпителия роговицы на всю его глубину, включая базальный слой. При этом Боуменова мембрана и передние слои стромы роговицы оставались без повреждений (Рис. 5).
На втором этапе исследований проводили моделирование доставки рибофлавина в строму роговицы по различным методикам УФ-кросслинкинга с определением степени проникновения в роговицу рибофлавина, что является необходимым условием результативности вмешательства. Исследования проводили совместно с аспирантом Мерзловым Д.Е.
Для обнаружения рибофлавина в строме роговицы нами впервые была применена инфракрасная Фурье-спектроскопия, являющаяся одним из наиболее распространенных физико-химических методов исследования структуры различных химических веществ. Исследование проводили на 9-и кадаверных глазах, в роговицах которых предварительно не было обнаружено каких-либо рубцов или помутнений.
Ход эксперимента заключался в следующем. Глаза были разделены на 3 группы по 3 глаза в каждой группе. В I группе перед закапыванием на роговицу раствора рибофлавина эпителий предварительно удаляли, что соответствовало условию выполнения УФ-кросслинкинга по стандартной методике (контроль). Во II группе эпителий не удаляли, а закапывали на него в течение 30 минут 0,5% раствор алкаина, содержащего бензалкония хлорид, увеличивающего проницаемость роговицы, тем самым моделируя этап доставки рибофлавина в строму роговицы по методике трансэпителиального УФ-кросслинкинга. В III группе для увеличения проницаемости эпителия проводили механическое нарушение его целостности с помощью описанного выше разработанного инструмента для дозированной скарификация эпителия роговицы. Затем выделяли роговицу и помещали ее на предметный столик ИК-микроскопа эндотелием вверх.
Рис. 5. Гистологический препарат человеческой кадаверной роговицы после применения инструмента для дозированной скарификации эпителия роговицы. Боуменова мембрана и передние слои стромы роговицы без повреждений Окраска гематоксилин-эозин, ув. х200
Таблица 1. Относительная интенсивность полос ИК-спектра в исследуемых группах
Далее раствор рибофлавина в течение 30 минут капельно наносили на переднюю поверхность кадаверной роговицы, после чего смывали физиологическим раствором до прозрачных смывных вод и удаляли эпителий, если он не был удален ранее.
Затем роговицу помещали на предметный столик ИК - микроскопа и с помощью его объектива регистрировали ИК - спектры отражения с разных участков роговицы со стороны эндотелия для выявления возможных флуктуаций. Проводили сравнение полученных ИК-спектров отражения, при этом о проникновении рибофлавина в роговицу свидетельствовало появление в ИК - спектре полос, характерных для рибофлавина.
Следует отметить, что для сравнительного анализа выбрали полосу 1542 см-1, которая относится к сопряженным связям «С=С» и «С=N» в конденсированных ароматических кольцах рибофлавина и менее всего подвержена влиянию растворителя, что приводит к сохранению интенсивности этой полосы в спектре раствора.
Количественной характеристикой изменения ИК-спектров служило изменение относительной интенсивности полос 1542 см-1 и 1640 см-1, выраженное в процентах. Полосу 1640 см-1 выбрали для сравнения в виду того, что она относится к той же пептидной связи, что и полоса 1542 см-1 и отражает в ней исключительно различный тип колебаний, следовательно, в одинаковых условиях их относительная интенсивность остается постоянной.
При анализе усредненного ИК-спектра отражения роговиц I группы (стандартная методика - контроль) выявили достоверное увеличение относительной интенсивности полосы 1542 см-1, на 7,3%±0,5%, что свидетельствовало о полном проникновении рибофлавина в строму роговицы. Отсутствие, в сравнении с контролем статистически значимого изменения ИК-спектра роговиц, на которые был нанесен 0,5% алкаин (II группа), указывало на отсутствие факта проникновения рибофлавина через эпителий роговицы, что ставит под сомнение эффективность трансэпителиального УФ-кросслинкинга. Наличие достоверных изменений относительной интенсивности полос ИК-спектра роговиц в III группе (на 7,8 ± 0,6 %) свидетельствовало о том, что дозированное механическое нарушение целостности эпителия обеспечивает полное пропитывание роговицы рибофлавином, что указывает на высокую эффективность вмешательства (таблица 1).
Таким образом, в ходе исследования было впервые доказано, что благодаря высочайшей специфичности ИК-спектров отражения для химических веществ, метод инфракрасной Фурье-спектроскопии может быть успешно использован для изучения возможности проникновения рибофлавина в строму роговицы, что является определяющим критерием эффективности УФ-кросслинкинга, в прямую зависящую от глубины проникновения рибофлавина в строму роговицы.
На заключительном этапе экспериментальных исследований проводили сравнение скорости восстановления целостности эпителия роговицы после моделирования различных методик УФ-кросслинкинга in vivo. Этот показатель является важным критерием безопасности УФ-кросслинкинга, учитывая, что большинство таких осложнений его послеоперационного периода, как роговичный синдром, вирусные и бактериальные кератиты обусловлены удалением эпителия во время операции [165, 316, 327, 426].
Исследование провели на 12 глазах 6 кроликах породы Шиншилла, распределенных на 3 группы по 2 кролика (4 глаза) в каждой группе. На глазах I группы проводили полную деэпителизацию роговицы (моделирование начального этапа стандартной методики УФ-кросслинкинга). Во II группе выполняли дозированную скарификацию эпителия роговицы при помощи описанного выше нового инструмента скарификатора (моделирование начального этапа методики дозированного УФ-кросслинкинга). В III группе на роговицы глаз кроликов инстиллировали 0,5% раствор алкаина, содержащего бензалкония хлорид (моделирование начального этапа методики трансэпителиального УФ-кросслинкинга). Дефекты эпителия диагностировали с помощью флуоресцеиновой пробы.
В результате исследований полную эпителизацию роговицы в I группе зафиксировали на 5-й день наблюдения, во II группе – на 2-й день эксперимента. Что касается III группы, то на протяжении всего периода наблюдения дефектов роговицы не обнаруживали.
Таким образом, в ходе проведенных исследований установили, что разработанный инструмент-скарификатор позволяет проводить дозированную скарификацию эпителия роговицы без опасности повреждения передних слоев ее стромы, обеспечивая при этом пропитывание всей ее толщины раствором рибофлавина. Данное обстоятельство предполагает снижение степени выраженности роговичного синдрома и риска развития послеоперационных инфекционных осложнений при его использовании на начальном этапе дозированного УФ-кросслинкинга в клинике.
Анализ результатов инфракрасной Фурье-спектроскопии убедительно свидетельствует о том, что после полной деэпителизации роговицы, также как и после дозированного нарушения целостности ее эпителия происходит пропитывание всей толщины стромы роговицы рибофлавином. Что касается применения раствора алкаина, содержащего бензалкония хлорид для увеличения проницаемости эпителия роговицы, то он не обеспечивает практически никакого эффекта проникновения рибофлавина в строму роговицы.
Результаты экспериментальных исследований in vivo свидетельствуют о восстановлении целостности эпителия роговицы после ее частичной деэпителизации на следующий день после операции, в то время как после полной деэпителизации роговицы эпителиальный покров восстанавливается только на 5-е сутки.
