Результаты экспериментально-морфологических исследований

     В данном разделе представлены сравнительные характеристики изменений в роговице после различных видов УФ-кросслинкинга, а также данные о распределении и локализации различных типов коллагена в норме и при кератоконусе на основе проведенных иммуногистохимических и электронномикроскопических исследований.

    

    

    3.1.1 Результаты гистохимического исследования структуры коллагена нормальной и кератоконусной роговицы в ходе моделирования процедуры кросслинкинга с применением фемтолазера ex vivo


    Гистоморфологическое изучение результатов стандартного КРК стромы нормальной донорской роговицы показало, что пучки коллагена стромы сшиваются между собой с формированием уплотнений бок в бок (рис.12).


    Наибольшее количество сшивок определяется в передней и средней строме роговицы. Часть кератоцитов имеет посмертные изменения, которые выражаются в деструкции мембран и ядер клеток (рис.13). Иммуноферментный анализ, проведенный нами на нормальной донорской роговице человека, подвергавшейся процедуре кросслинкинга, позволил выявить коллаген типа I стромы роговицы посредством окрашивания комплексов моноклональных антител с сайтами связывания (рис. 13).


     На нормальной донорской роговице человека, подвергавшейся процедуре кросслинкинга (рис. 14 а), показано равномерное распределение волокон, содержащих коллаген типа I (А) в основной массе коллагеновых волокон стромы, что указывает на его доминирование по отношению к другим типам коллагенов. Кроме того, видно, что сшивки (обозначены стрелками) в результате кросслинкинга возникают в основном между волокнами коллагена типа I. Количественное определение коллагена типа I и II показало, что их содержание после проведения КРК не изменяется и лежит в пределах 50-55% для коллагена I типа и 30% для коллагена типа II. Эти данные также согласуются с результатами других авторов [63,144].


    Кроме того, видно, что сшивки (обозначены стрелками) в результате кросслинкинга возникают в основном между волокнами коллагена типа I. Количественное определение коллагена типа I и II показало, что их содержание после проведения КРК не изменяется и лежит в пределах 50 -55% для коллагена I типа и 30% для коллагена типа II. Эти данные также согласуются с результатами других авторов [63,144].


    Данные морфометрического анализа локализации и содержания других типов коллагена в донорской роговице показали, что коллаген VI типа распределен наравне с коллагеном I типа в виде длинных волокон без характерной для коллагена I типа исчерченности (рис. 14 б). Количественное содержание коллагена VI типа в нормальной роговице до и после КРК составило 25-30 % [63,144].


    При проведении кросслинкинга на нормальной роговице с фемтолазерным формированием тоннеля для ведения рибофлавина возникают плотные сшивки коллагена как в продольных, так и в поперечных волокнах вокруг зоны тоннеля (рис.15).


     Количество зон сшивок при тоннельном способе введения рибофлавина, посчитанные методом точечного счета с помощью окулярной стереометрической сетки, значительно больше, чем при стандартном кросслинкинге. Возможно, это связано с таргетированной доставкой рибофлавина в строму роговицы и прямой реакцией со стромальным коллагеном и, следовательно, с более эффективным процессом кросслинкинга.


    В роговице с кератоконусом после стандартной процедуры кросслинкинга наибольшее количество сшивок определяется в передней и средней строме как между сохранными, так и между разволокненными фибриллами. В основном сшивке подвергаются продольные и поперечные волокна коллагена типа I (рис.16 а, б).


     Проведенные иммуногистохимические исследования роговиц пациентов с кератоконусом показали значительное изменение в качестве всех типов коллагенов в результате деструкции. Так, количество коллагена типа I, по данным гистоморфометрии, понизилось до 35 -45% по сравнению с нормой (55%). В результате развития патологического процесса строма роговицы теряет свою ортогональную ориентацию фибрилл, которые также скручиваются по своей оси (рис.17).


    Другие типы коллагена стромы также изменяются в количественном и качественном отношении в результате развития кератоконуса. Так, количество коллагена типа III, IV и VI (рис.18), посчитанное методом точечного счета с помощью окулярной стереометрической сетки, уменьшается в среднем на 25 – 30% по сравнению с нормой. Однако изменений в локализации и количественных характеристиках типов коллагенов после проведения различных вариантов КРК обнаружено не было.


    Таким образом, результаты экспериментальных иммуногистохимических исследований показали, что в нормальной и кератоконусной роговице под действием УФ кросслинкинга образуются устойчивые сшивки, в основном между фибриллами I типа коллагена. При проведении кросслинкинга с фемтолазерным формированием тоннеля количество и плотность сшивок увеличивается, что вероятно связано с более эффективным распределением рибофлавина непосредственно в строме.


     Распределение и локализация в роговице различных типов коллагена под действием УФ кросслинкинга не изменяется, а возникающие сшивки концентрируются в основном на коллагене I типа.


    3.1.2. Результаты электронно-микроскопического исследования ультраструктуры стромы роговицы после проведения вариантов процедуры кросслинкинга


    Результаты проведенных электронно-микроскопических исследований показали, что через неделю после операции у животных 1 группы сразу под эпителием идет формирование продольных и поперечных сшивок коллагена, которые сконцентрированы вблизи базальной мембраны эпителия (рис.19).


    Сшивки коллагена под эпителием (А) и в поверхностных слоях стромы (В) (электронная трансмиссионная микроскопия, ув. х6000) К 1 месяцу после процедуры кросслинкинга с применением фемтолазера сшивки коллагена в основном представлены в поверхностных слоях стромы (рис.20).


     На сроке 3 месяца после процедуры сформированные сшивки сохраняются (рис.21).


    При большем увеличении в поверхностных слоях стромы определяются пласты сшитых волокон и пучков коллагена (рис.22). Часть волокон сшито бок в бок, другая часть - конец в конец.


    На всех сроках наблюдения на препаратах 1 группы не обнаруживали явлений воспаления либо других осложнений.


    Во второй группе сравнения эпителизация роговицы происходила на 2-3 сутки после процедуры и через 1 неделю после стандартной процедуры кросслинкинга визуализировали отечные базальные клетки эпителия с признаками полиморфизма и увеличенными межклеточными пространствами, а также базальная мембрана с выраженными полудесмосомами. Это, по нашему мнению, свидетельствует о травматичности этапа удаления эпителия. В подлежащей строме видны участки поперечно сшитых коллагеновых волокон и фибрилл (рис. 23).


     Через 1 месяц после стандартной процедуры кросслинкинга базальная мембрана плотная, в поверхностных слоях стромы роговой оболочки коллагеновые волокна и фибриллы сшиты бок в бок и конец в конец. Волокна коллагена выглядят хаотически уложенными. Межуточное вещество сжато, волокна плотно соприкасаются друг с другом (рис. 24).


    Через 3 месяца в роговице животных 2-ой группы волокна коллагена в продольном и поперечном направлении остаются сшитыми (рис.25).


    Проведя анализ микроснимков трансмиссионной электронной микроскопии после фемтокросслинкинга и стандартного КРК на всех сроках наблюдения, было выявлено одинаковое количество сшивок волокон коллагена, что можно расценить, как равноценный эффект обоих методов.


     В роговицах кроликов контрольной группы заживление эпителия и роговичной стромы на всех сроках после фемтолазерного формирования кармана, без последующей процедуры кросслинкинга, проходило без каких-либо особенностей. Изменений эпителия и базальной мембраны над стромальным карманом не визуализировали. Через 1 месяц после фемтолазерного формирования кармана эпителий и субэпителиальный слой, а также ход волокон в зоне формирования кармана были не изменены, определяли единичные кератобласты (рис.26).


    Таким образом, исследование состояния ультраструктуры коллагена стромы роговицы экспериментальных животных выявило сопоставимые изменения в группах стандартного КРК и фемтокросслинкинга, проявляющиеся в одинаковом количестве появившихся сшивок волокон коллагена и сохраняющихся на всех сроках наблюдения, что говорит об одинаковом эффекте методик. Выявленные изменения в базальной мембране в виде отечных базальных клеток эпителия с признаками полиморфизма и увеличенными межклеточными пространствами после стандартного КРК свидетельствуют о травматичности этапа удаления эпителия в отличие от методики КРК с введением рибофлавина в стромальный карман, сформированный фемтолазером.