Результаты исследования степени регенеративной активности тканей глазного яблока в зависимости объёмов введения нанодисперсной плаценты

     3.5.2.1 Клиническая оценка введения суспензии нанодисперсной плаценты в эксперименте



    Отмечено, что послеоперационный период у крыс всех четырех исследуемых групп (трёх опытных, одной контрольных) протекал без видимых осложнений (n = 80, 160 глаз).



    Какого-либо отделяемого из конъюнктивального мешка у опытных животных не отмечено.



     На 3-и сутки исследования наблюдалась незначительная смешанная инъекция конъюнктивы глазного яблока животного в зоне инъекции суспензии нанодисперной плаценты, интенсивность которой уменьшалась в зависимости от удаленности от места введения биоимплантата. Степень инъекции была более выраженной в третьей опытной группе. Инъекция полностью исчезала к четырнадцатым суткам эксперимента.



    Полнокровия эписклеральных сосудов в зоне инъекции суспензии нанодисперной плаценты не отмечалось. Отёк слизистой оболочки наблюдался локально только в зоне инъекции суспензии в ранние сроки исследования на 3-и сутки, при этом он больше отмечался у животных третьей опытной группы, затем отёк слизистой исчезал.



     Роговица у всех животных была прозрачная (n = 80), влага передней камеры также была прозрачной без примеси каких-либо элементов. Отёка стромы радужки и задних синехий ни в одном случае отмечено не было.



    Офтальмоскопия глазного дна показала наличие прозрачности оптических сред у всех опытных животных (n = 80), при этом какой-либо патологии в виде гиперимии диска зрительного нерва, полнокровия сосудов глазного дна, кровоизлияний в сетчатку или в стекловидное тело не отмечено.



     3.5.2.2 Морфологические исследования степени регенеративной активности тканей глазного яблока в зависимости объёмов введения нанодисперсной плаценты



    В ранние сроки после имплантации (на 3-и сутки) в контрольной группе животных местные изменения проявлялись в виде умеренного асептического воспаления (Рисунок 30). В первой опытной группе при введении 5 мг суспензии нанодисперсной плаценты лейкоцитарные реакции в окружающей конъюнктиве были более выражены по сравнению с контрольной группой животных (Рисунок 27). В зоне введения суспензии нанодисперсной плаценты преобладали клетки лимфоцитарного ряда, выявлялись единичные нейтрофильные и эозинофильные гранулоциты. Наблюдалось умеренное расширение микрососудов. Во второй опытной группе при введении 15 мг суспензии нанодисперсной плаценты у всех исследованных животных проявления воспалительного ответа были более выражены, при этом инфильтрация клеточными элементами носила умеренный характер и проявлялась в преобладании нейтрофильно-клеточных ответов (Рисунок 29). Существенно увеличивалась толщина конъюнктивы в первую очередь за счёт признаков эксудации. Возникали проявления умеренного отёка межклеточного вещества конъюнктивы и поверхностных участков склеры с разволокнением коллагеновых пластинок последней. Расширение микрососудов не сопровождалось морфологическими признаками стаза. В третьей опытной группе при введении 25 мг суспензии нанодисперсной плаценты морфологические изменения были близки к животным, которым было введено 15 мг суспензии, но изменения были более выражены, в первую очередь в виде лейкоцитарных клеточных реакций, также носивших очаговый характер (Рисунок 29).



     На 3-и сутки после введения у животных первой опытной группы методом атомно-силовой микроскопии в прилежащих месту введения суспензии нанодисперсной плаценты выявлены признаки умеренного разрыхления пластинок коллагеновых волокон, обусловленных отёком аморфного компартмента межклеточного вещества (Рисунок 33). Коллагеновые волокна сохраняли D-исчерченность и компактное расположение в пределах пластинок. В лонгитудинальном направлении в коллагеновых волокнах сохранялся равномерный диаметр, что указывало на отсутствие в них признаков деструктивных изменений. На микросканограмме, кроме описанных коллагеновых пластинок, имелся участок с частицами введенной нанодисперсной плаценты, представленными агломератами 0,2-0,3 мкм.



    При введении 25 мг вышеупомянутого материала выявлены изменения структуры коллагена в виде потери либо резкого уменьшения проявлений поперечно-полосатой исчерченности (Рисунок 32). Волокна разрыхлены, между ними выявлялось резкое увеличение объёма аморфного матрикса. Пластинки теряли упорядочное распределение, отдельные волокна формировали зоны утолщений, по-видимому, на фоне повышенной гидрофильности. Всё это указывало на деструктивные процессы в межклеточном веществе склеры, прилежащем к месту введения нанодисперсной плаценты.



     На 7-е сутки начинались процессы ранней реэпителизации зоны введения, что имело место как у контрольных, так и во всех группах опытных животных. В контрольной группе в зоне введения физиологического раствора были видны единичные мононуклеары. Явления периваскулярного отёка были незначительны. В первой опытной группе отмечались инфильтративно-эксудативные процессы в виде лимфоцитарно-моноцитарных клеточных ответов, умеренной инфильтрации мононуклеарами в участках конъюнктивы и поверхностных слоях склеры в зоне введения суспензии (Рисунок 33). Выявлялось умеренное расширение сосудов микроциркуляторного русла. Помимо этого отмечались пролиферативно-фибробластические ответы в виде клеточных тяжей из фибробластов, разделенных нежными волокнистыми структурами. У животных второй и третьей опытных групп проявления асептических экссудативно-клеточных реакций были более выражены. Это проявлялось в значительном числе клеток лейкоцитарного ряда в зоне введения суспензии нанодисперсной плаценты, с преобладанием моноцитарно-макрофагических и нейтрофильно-клеточных ответов (Рисунок 34, Рисунок 35).



    На 14-е сутки после инъекции у контрольных животных в участках конъюнктивы наблюдались признаки реэпителизации. У животных первой опытной группы зоны посттравматического дефекта также подвергались реэпителизации. В зоне введения суспензии нанодисперсной плаценты выявлялись признаки умеренной инфильтрации мононуклеарами и немногочисленными полиморфноядерными клетками без явлений набухания клеток и отёка межклеточного вещества (Рисунок 36). Дополнительно обнаруживалось значительное число клеток фибробластического ряда с наличием фигур митозов. Отмечено увеличение числа функционирующих кровеносных микрососудов, появление эндотелиально-клеточных тяжей и эндотелиальных почек роста, указывающих на активацию репаративного ангиогенеза в рассматриваемый срок. В поверхностных участках склеры, в зоне введения суспензии нанодисперсной плаценты формировались обильные сети нежных коллагеновых волокон, указывающих на активный коллагеногенез. У животных второй опытной группы сохранялись проявления локальных асептических экссудативно-пролиферативных реакций (Рисунок 37). Имелось множество клеток моноцитарно-макрофагического и фибробластического рядов. В поверхностных учатках склеры наблюдались признаки отёка с увеличением объёма аморфного компонента межклеточного вещества и разобщения пластинок коллагеновых волокон. Выявлялись отдельные плазмоциты и лимфоциты. Нередко обнаруживались фигуры митозов. Отмечались гипертрофированные фибробласты, что косвенно указывало на значительное повышение их функциональной активности и подтверждалось усилением коллагенообразования, значимо превышающим аналогичные явления в контрольной и первой опытной группе. Имелось много как функционирующих кровеносных капилляров, так и прорастающих превазоидов и эндотелиальных почек роста. В третьей опытной группе также сохранялись признаки местного воспалительного процесса (Рисунок 38). Эти изменния у животных второй опытной группы были ещё более выражены.



     На 30-е сутки в первой опытной группе по сравнению с контрольной толщина склеры была увеличена за счёт новообразованных коллагеновых волокон с множеством вновь сформированных сосудов, активных фибробластов (Рисунок 39). Новообразованная соединительная ткань по плотности приближалась к отдаленной от зоны имплантации. Макромолекулярная организация вновь образованных коллагеновых волокон указывала на высокую степень их морфологической зрелости. Волокнистая организация межклеточного вещества склеры приобретала упорядоченный характер. Во второй (Рисунок 40) и третьей (Рисунок 41) опытной группе по сравнению с первой процесс коллагенообразования имел более диффузный и выраженный характер.



    Проведённые морфометрические исследования отражены в Таблице 4. Количество делящихся клеток определялось в поле зрения равном 0,01 мм² . При этом достоверно значимо (p < 0,001) и прямопропорционально определялось нарастание количества клеток на единицу площади от одной группы к другой по мере увеличения дозы сухого вещества нанодисперсной плаценты. Отсюда следует вывод, что увеличение дозы вводимого в ткани реципиента сухого вещества нанодисперсной плаценты прямопропоционально усиливает клеточный ответ соединительнотканной структуры конъюнктивы глаза крысы (Рисунок 42). Оптимальной в данной ситуации следовало считать дозу вводимого сухого вещества нанодисперсной плаценты равной 5 мг, так как достоверно значимо усиливался клеточный ответ соединительнотканных структур конъюнктивы глаза крысы, а негативного (избыточного) ответа не наблюдалось. Тогда как при введении сухого вещества нанодисперсной плаценты в дозах 15 мг и 25 мг наблюдался чрезмерно выраженный клеточный ответ, который мог носить отрицательный характер в виде избыточного коллагенообразования и формирования грубого рубца в зоне введения. Напрашивается вывод, что стимуляция регенеративной активности соединительнотканных структур конъюнктивы глаза крысы возможна минимальной дозой вводимой нанодисперсной плаценты, а высокие концентрации нанодисперсной плаценты чрезмерно усиливают клеточный ответ в тканях реципиента, который может иметь даже негативный характер. Следовательно, применение нанодисперсной плаценты в клинической практике требует использование её минимальных концентраций.



     Из полученных результатов напрашивается вывод о том, что суспензия нанодисперсной плаценты в дозе 5 мг оказывала выраженное модулирующее действие в зоне её введения в виде усиления пролиферативных и регенеративных процессов в соединительной ткани с усилением коллагенообразования и ангиогенеза в ранние сроки после оперативного вмешательства. При этом морфологические изменения носили преимущественно очаговый характер, в последующем приобретая диффузный. Применение суспензии нанодисперсной плаценты в дозах 15 мг и, особенно, 25 мг чрезмерно усиливало проявления репаративных и асептических воспалительных процессов, что могло носить даже негативный характер и приводить к избыточному рубцеванию в зоне введения. Всё это предполагает необходимость контроля за вводимым объёмом (дозой) нанодисперсной плаценты.



     Таким образом, подводя итог предварительному этапу работы можно заключить, что с помощью метода механоактивации в шаровой планетарной мельнице при использовании следующих параметров: температуре не более 60 ° С, величине подведенной удельной энергии менее 15 кДж/г, времени воздействия в течение 60 минут, можно получить ультрадисперсный биологический материал, в частности нанодисперсную плаценту человека, с размерами зерна вещества 40-100 нм. При этом в результате механоактивации химический состав плаценты не изменялся, а зёрна полученной нанодисперсной плаценты за счет физической адгезии связывались между собой в частицы размером от 200 до 500 нм, которые в свою очередь образовывали слабосвязанные агломераты размером от 2 до 10 мкм. Кроме того, нанодисперсная плацента в процессе механоактивации приобретала новые биофизические свойства: повышенную гидрофильность, проницаемость и биодоступность за счёт высокой диффузионной способности, возможность вызывать регенеративные процессы соединительнотканных образований при минимальных объёмах введения экстрабульбарно. В опытах на экспериментальных животных был разработан клинический алгоритм применения нанодисперсной плаценты как в виде биоимплантата, так и в виде суспензии через иглу с минимальным диаметром 29 G, что позволяло значительно уменьшить объём введения донорского материала, травматичность техники имплантации и длительно сохранить максимально выраженные биологические эффекты in vivo. С учетом результатов экспериментальных исследований был разработан биоимплантат на основе фрагмента сосуда пуповины, содержащий нанодисперсную плаценту для имплантации в экстрабульбарные структуры. Отмечено, что оптимальный объём введения нанодисперсной плаценты соответствовал количеству 5 мг сухого вещества. При этом объёме введения нанодисперсной плаценты вызывались значительные биологические эффекты в зоне имплантации в виде умеренного макрофагально-клеточного ответа и активации фибробластических и эндотелиобластических реакций в соединительных тканях глаза реципиента.