Современное представление об УФ-кросслинкинге роговичного коллагена

    Концепция так называемого перекрестного сшивания, или кросслинкинга, достаточно давно используется в промышленности. Формирование ковалентных связей между длинными молекулами полимера для повышения прочности материалов используется при производстве пластмасс для биопротезов сердечных клапанов. Основанием к разработке метода КРК послужили наблюдения за изменением биомеханической стабильности роговичного коллагена под влиянием возрастных изменений. Было замечено, что степень связывания волокон коллагена зависит от активности ряда ферментов экстрацеллюлярного матрикса стромы, связывающих аминогруппы и альдегидгруппы аминокислот коллагеновых волокон между собой. Проводимые зарубежные исследованияв рамках научных программ по изучению тканевой инженерии, показали, что помимо ферментативного способа связывания коллагеновых волокон возможно применение для этой цели химических агентов (глутаральдегида, формальдегида или дифенилфосфорилазида) или фотохимического воздействия [129].

    Разработке возможностей последнего были посвящены многолетние исследования, среди которых значительную роль сыграли работы группы ученых Института рефракционной и глазной хирургии Цюрихского университета (Швейцария) T. Seiler, G. Wollensak, E. Spoerl (1998) [129-132].

    Для фотохимического кросслинкинга авторами было предложено использование рибофлавина (витамин В2) в качестве фотосенсибилизатора, активируемого с помощью ультрафиолетового излучения в диапазоне длин волн спектра А. Выбор был обусловлен нетоксичностью рибофлавина для роговичной ткани, доступностью препарата и сохранением прозрачности при нанесении на роговицу. Рибофлавин является гидрофильным соединением с молекулярной массой 376,37 г/моль, обладающим тремя пиками абсорбции для УФ излучения на длинах волн 270, 366 и 445 нм. Параметры поглощения крайне важны с точки зрения предотвращения негативного воздействия ультрафиолетового излучения за пределами роговицы, в частности повреждения им глубжележащих структур глаза – хрусталика и сетчатки. Таким образом, при КРК рибофлавин играет одновременно роль фотосенсибилизатора, а также поглощает УФ излучение для предотвращения поражения внутриглазных структур. В процессе КРК образуются свободные радикалы, в том числе и синглетный кислород, которые катализируют реакцию, приводящую к образованию ковалентных связей (сшивок) между гликопротеиновыми полимерами (протеогликанами), располагающимися на поверхностях коллагеновых волокон [122]. Вероятно, данные межволоконные сшивки и определяют эффект кросслинкинга [142].

    Был изучен химический кросслинкинг с алифатическими спиртами В-нитро, однако при данном методе сложно локализовать эффект и может возникнуть, по мнению исследователей, кросслинкинг соседних структур (трабекулярной сети, склеры, конъюнктивы и т.д.) [110]. А.В. Кузнецовым (2014) было проведено исследование по возможности применения в качестве фотосенсибилизатора препарата фталоцианинового ряда («Фотосенс») для проведения КРК [25].

    Эффекты кросслинкинга на роговицу

    После процедуры кросслинкинга был выявлен и описан апоптоз кератоцитов на глубину до 300 мкм, причем эффект был пропорционален дозе облучения [143,147]. Уменьшение плотности кератоцитов после КРК было подтверждено конфокальной микроскопией, которая является полезным методом для качественного анализа роговицы invivo. Исследования, проведенные с использованием конфокальной микроскопии после КРК, показали отек стромы, потерю субэпителиальных нервных сплетений и увеличение рефлективности в средней строме [9,62,118]. Через 3-12 месяцев после лечения происходит репопуляция кератоцитов одновременно с регенерацией нервных сплетений и ламеллярной компактизацией [89,101,102]. Был сделан вывод, что репопуляция кератоцитов и увеличение рефлективности внеклеточного матрикса является причиной послеоперационного субэпителиального хэйза, который выявляется при биомикроскопии [103].

    При проведении электрофоретических исследований G. Wollensak с соавт. (2004) продемонстрировали увеличение диаметра коллагеновых волокон после КРК в передней строме на 12,2 % и в задней строме на 4,6%, что приводило к повышению биомеханической устойчивости роговицы [144,145,148]. Данные электронной микроскопии свидетельствовали о факте «склеивания» фибрилл под воздействием рибофлавина и ультрафиолетового излучения.

    В исследованиях G. Wollensak, E. Spoerl, T. Seiler (2004) сообщается о росте устойчивости коллагена к ферментативному разрушению после КРК, что в свою очередь приводит к увеличению биохимической и биомеханической стабильности роговицы [144,145].

    Также G. Wollensak, E. Spoerl, T. Seiler (2003) отметили увеличение жесткости роговицы на 328 %, а модуля Юнга в 4,5 раза при сравнении коллагена после КРК с контрольной группой [144].

    Ряд исследований был посвящен изучению безопасности КРК. G. Wollensak, E. Spoerl, T. Seiler (2003) показали, что в роговице кроликов цитотоксический эффект на эндотелий наблюдался при мощности УФ излучения 0,36 мВт/см², который может быть достигнут в роговице человека толщиной менее 400 мкм [144]. Таким образом, для обеспечения безопасности эндотелиальных клеток КРК может быть рекомендован при минимальной толщине стромы 400 мкм.

    Основываясь на этих выводах были предложены четыре критерия для «безопасного» проведения процедуры КРК:

    1. Эпителий должен быть удален для беспрепятственного проникновения рибофлавина в строму

    2. УФ облучению должна предшествовать инстилляция 0,1 % раствора рибофлавина в течение 30 минут

    3. Мощность УФ-излучения должна быть 3 мВт/см²

    4. Толщина стромы должна быть не менее 400 мкм

    Стандартная методика КРК

    Наиболее широко используемым протоколом лечения является Цюрихский протокол (2003) [142].

    Процедура КРК проводится под инстилляционной анестезией. Методика предполагает механическое, с помощью шпателя, удаление роговичного эпителия диаметром 9 мм, поскольку он может препятствовать достаточному насыщению роговичной стромы раствором рибофлавина. За 30 минут до УФ облучения инстиллируется 0,1 % раствор рибофлавина. Затем проводится облучение ультрафиолетовым светом длиной волны 375-376 нм и плотностью мощности 3 мВт/см² в течение получаса. В течение 30-минутной процедуры каждые 4-5 минут инстиллируется раствор рибофлавина и анестетика. По окончании процедуры в глаз закапываются антибактериальные капли и накладывается бандажная контактная линза.

    Клинические исследования КРК

    За последние 10 лет КРК прочно вошел в клиническую практику во всем мире. На фоне растущего числа публикаций, сообщающих о его безопасности и эффективности в лечении прогрессирующего кератоконуса, рандомизированных контролируемых исследований, посвященных КРК, было проведено не так и много.

    Первое сообщение о клинических результатах лечения 23 глаз 22 пациентов КРК было опубликовано G. Wollensak, E. Spoerl, T. Seiler (2003) [142]. Авторы отмечают стабилизацию прогрессирования кератоконуса и снижение кривизны роговицы максимально до 2,0 дптр на 16 пролеченных глазах. Последующие исследования показали уменьшение сферического эквивалента рефракции, увеличение некорригированной и корригированной остроты зрения, уменьшение топографических индексов и повышение симметричности роговицы. При этом на интактных глазах контрольной группы отмечали прогрессирование заболевания [132,142].

    A. Caporossiс соавторами (2010) в своем исследовании отмечают ухудшение кератометрических показателей, наблюдаемых в первый месяц после процедуры КРК, которое авторы связывают с послеоперационным хейзом и отеком роговицы [54]. Аналогичные результаты приводят М. Doors с соавторами (2009), которые предполагают, что данное ухудшение связано с ремоделированием роговицы в первый месяц [65]. Противоположное мнение в своем исследовании высказывают Р. Vinciguerra с соавторами (2009), которые считают, что ухудшение кератометрических показателей может быть результатом удаления эпителия [136]. В своем исследовании авторы сообщают о полученных аберрометрических результатах со значительным снижением общих и всех роговичных аберраций до седьмого порядка, а также о значительном уменьшении комы, преобладающей среди всех аберраций высшего порядка при кератоконусе. Последующие работы А. Caporossi, С. Mazzota (2011) основывались на 4-х летних наблюдениях. Авторы в своем исследовании разделяют пациентов на три возрастные группы: до 18 лет, от 19 до 26 лет, и старше 27 лет. Вследствие наименьшего рефракционного эффекта после КРК у пациентов третьей группы авторы делают вывод, что КРК является операцией выбора для пациентов до 27 лет [54].

    Отдаленные результаты процедуры при 6-летнем периоде наблюдения были представлены Е. Spoerl в 2008 г. В исследовании участвовало 130 пациентов (241 глаз) и было отмечено улучшение кератотопографических показателей и остроты зрения у большинства пациентов на фоне приостановки прогрессирования кератоконуса [114].

    При определении оптимальных для КРК дооперационных параметров T. Kollerс соавторами (2011) в своей работе делают заключение, что предоперационная кератометрия 54,0 дптр и больше, имеет приоритетное значение при назначении КРК [86]. Авторы в своем исследовании сообщают о максимальном уплощении роговицы до 7,2 дптр после КРК. Напротив, Т. Asri с соавторами высказывают мнение, что предоперационное значение кератометрии больше 58,0 дптр, возраст более 35 лет и женский пол в равной степени являются факторами риска для послеоперационной прогрессии кератоконуса [49]. Учитывая эти два исследования можно сделать вывод, что оптимальный диапазон кератометрии роговицы для КРК находится между 54,0 и 58,0 дптр.

    Исследования, направленные на изучение динамики пахиметрических данных в результате КРК показали разные результаты, при этом некоторые авторы не обнаруживают изменений, в то время как другие находят уменьшение толщины роговицы до 20 мкм в течение 12 месяцев [55,136]. Также есть сообщения об увеличении данных пахиметрии на 21 мкм в последующие 24 месяца после КРК [55].

    Варианты хирургической техники КРК

    КРК на тонкой роговице

    F. Hafezi с соавт. (2009), основываясь на работах G. Wollensak, представили усовершенствованную технику КРК при толщине стромы менее 400 мкм с использованием гипоосмолярного рибофлавина, вызывающего набухание роговицы [75]. За счет этого, по мнению авторов, в процессе процедуры удается увеличить толщину роговицы на 15-20%.

    E. Messmer с соавт. (2013) были проведены исследования по эффективности КРК на роговице толщиной менее 400 мкм. Посредством подсчета кератоцитов при проведении иммуногистохимии на глазах после СКП не было обнаружено различий между роговицами после инстилляций гипоосмолярного рибофлавина и роговичными дисками после применения изотонического раствора рибофлавина [102].

    Клиническое исследование, проводившееся на 32 глазах в течение 12 месяцев с использованием гипоосмолярного рибофлавина, не определило изменений среднего эквивалента рефракции и остроты зрения [101,112].

    В своей работе G. Kymionis с соавторами (2012) описывают использование цюрихского протокола в лечении 14 глаз с толщиной роговичной стромы менее 400 мкм [90]. Спустя 12 месяцев авторы обнаружили статистически значимое снижение плотности эндотелиальных клеток (с 2733 до 2441 клеток на мм²), несмотря на улучшение остроты зрения и сферического эквивалента рефракции.

    Комбинация КРК с рефракционными операциями

    По сообщениям G. Kymionis с соавторами (2011), в настоящее время все большее количество клиник по всему миру проводят процедуру, сочетающую ФРК с последующим КРК при кератоконусе [89,91]. Авторы также сообщали о значительном улучшении остроты зрения на 0,46 Log MAR после 19 месяцев наблюдения. Средний сферический эквивалент уменьшился с 2,30 до 1,08 дптр. Однако в 10% на пролеченных глазах произошло снижение остроты зрения на одну строку [91].

    Е. Coskunseven с соавторами (2009) провели 7-месячное рандомизированное сравнительное исследование результатов выполненных операций КРК с последующей имплантацией интракорнеальных сегментов (ИИРС) и КРК, проведенного после ИИРС [56]. Интервал между вмешательствами в обеих группах составлял 7 месяцев. В результате исследования выявили улучшение остроты зрения, сферического эквивалента, цилиндрического компонента рефракции и значений кератометрии в обеих группах, однако суммарный эффект был больше в группе, где КРК проводили после ИИРС.

    А.В. Пенкина (2012) в своем исследовании провела анализ влияния комбинированного лечения кератоконуса (сочетание в различной последовательности КРК с фемтолазерной имплантации ИРС) на биомеханические свойства роговицы. В результате работы был сделан вывод, что «комбинированное лечение кератоконуса в последовательности: 1этап - фемтолазерная имплантация ИРС, 2 этап - кросслинкинг роговичного коллагена с интервалом не менее 6 месяцев, в наибольшей степени индуцирует комплекс морфологических изменений роговицы, улучшая её биомеханические свойства, доказательством чего служит повышение показателей корнеального гистерезиса и фактора резистентности роговицы» [37].

    Продолжительность облучения

    К. Rocha с соавторами (2008) была предложена методика «Flashlinking», в которой предлагался новый сшивающий агент поливинилпиролидон вместо рибофлавина и время УФ облучения составляло всего 30 секунд при 4,2 мВт/см² [119]. Проведя измерения прочностных свойств роговицы с использованием эластометрии на свиных глаз ex vivo, авторы метода предположили, что «Flash-linking» и стандартный КРК могут иметь сопоставимый эффект.

    Тем не менее, остается до конца невыясненным вопрос оптимальных параметров УФ излучения для достижения полноценного эффекта сшивания. Предложены модификации с изменением концентрации рибофлавина и мощности УФ. Некоторые исследователи высказывают мнение, что использование более высокой мощности УФ с меньшим временем экспозиции может иметь эффект, равный стандартному КРК [56].

    В исследовании по применению более высокой концентрации рибофлавина был сделан вывод, что для лечения тонкой роговицы использование повышенной концентрации рибофлавина может быть безопаснее за счет линейной зависимости между коэффициентом поглощения и концентрацией рибофлавина [106].

    Ионофорез

    Ионофорез предполагает использование небольшого электрического тока для усиления проникновения препарата в ткани. В литературе есть сообщения о способности ионофореза увеличивать проникновение рибофлавина в строму роговицы [138]. Рибофлавин подходит для ионофореза из-за его низкой молекулярной массы, растворимости в воде и отрицательного заряда. При использовании данной методики уменьшается время, необходимое для насыщения стромы рибофлавином, а также КРК может быть выполнен через интактный роговичный эпителий. Доклинические испытания показали эффективность этого метода в увеличении механической жесткости роговицы [137]. Исследование этой перспективной новой техники продолжается.

    Локальный КРК

    С.И.Анисимовым и соавторами (2011) разработана технология локального УФ-кросслинкинга. Она предполагает использование на этапе УФ-облучения индивидуальных маскок, формирующих форму падающего светового потока и позволяющих облучать роговицу пациента локально, воздействуя непосредственно на место эктазии и участки со сниженной ригидностью, учитывая их топографическое положение. После проведения УФ-кросслинкинга по данной технологии, авторы отмечали повышение остроты зрения на 2–4 строки и уменьшение роговичного астигматизма на 1– 3,5 дптр. [5,17].

    Трансэпителиальный КРК

    Предметом споров остается вопрос о необходимости полного удаления эпителия перед КРК в связи с выраженным болевым синдромом и риском послеоперационных осложнений, которые являются результатом деэпителизации. Так как рибофлавин не может проникать через интактный эпителий в достаточном количестве, были представлены различные методы для улучшения насыщения роговичной стромы рибофлавином [80]. Такие методы предполагают использование до операции капель, содержащих консервант бензалкония хлорид для ослабления эпителиальных межклеточных связей, либо удаление лишь поверхностного слоя эпителия без полной деэпителизации. Однако исследования на животных показали уменьшение и неоднородность поглощения рибофлавина стромой роговицы при неполном удалении эпителия [77,125]. Кроме того, при применении методики с использованием консервантов достигается лишь одна пятая часть биомеханического эффекта [146].

    Таким образом, пока методика трансэпителиального КРК набирает популярность, в рецензируемой литературе имеется весьма ограниченный ряд статей, описывающих благоприятные клинические результаты. Одно из первых подобных исследований было опубликовано C. Chan, M. Sharma, B. Wachler (2007), которые описали технику имплантации интракорнеальных сегментов с предварительным КРК для лечения кератоконуса [57]. Результатом процедуры было уменьшение цилиндрического компонента рефракции, а также средней и максимальной кератометрии.

    В исследовании трансэпителиального КРК, представленном А. Leccisotti и Т. Islam (2010), использовался раствор рибофлавина, содержащий 0,3% гентамицин, 0,01% этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) и 0,01% бензалкония хлорид, который инстиллировали каждые 15 минут в течение трех часов [93]. В послеоперационном периоде было получено улучшение остроты зрения на 0,036 LogMAR, сферического эквивалента на 0,35 дптр и значений среднего кератометрического индекса лишь на 0,1 дптр. Эти результаты указывают на меньший эффект по сравнению с методикой КРК с удалением эпителия, что в свою очередь доказывает необходимость исследования степени кросслинкинга, необходимой для остановки прогрессирования кератоконуса.

    M. Filippello, E. Stagni, D. O'Brart (2012) аналогично использовали модифицированный раствор рибофлавина, содержащий трометамол и натрия ЭДТА для ослабления эпителиальных межклеточных связей [71]. Послеоперационные обследования переднего сегмента с помощью оптической когерентной томографии продемонстрировали появление на границе произошедшего в роговице кросслинкинга демаркационной линии на глубине 100 мкм, в сравнении с демаркационной линей на глубине 320 -340 мкм при стандартном КРК [50]. Это говорит о том, что эффект трансэпителиального КРК более поверхностный.

    Измайлова С.Б., Мерзлов Е.В. предложили методику УФ-кросслинкинга с дозированной скарификацией эпителия с использованием специального инструмента – скарификатора, обладающего рабочей поверхностью с микроиглами, повторяющей форму роговицы, с возможностью его центрации на роговице, позволяющий одним движением проводить «равномерную, дозированную скарификацию эпителия роговицы, не повреждая при этом боуменову мембрану и передние слои стромы. Клинические исследования показали отсутствие прогрессирования кератоконуса у всех пациентов, которым провели УФ-кросслинкинг по технологии с дозированной скарификацией эпителия роговицы, а динамика показателей некорригированной остроты зрения, максимально корригированной остроты зрения, средней кератометрии, максимальной кератометрии, центральной толщины роговицы, и плотности эндотелиальных клеток была сопоставима с таковой после УФ-кросслинкинга по классической технологии» [20,34].

    Перспективной представляется техника КРК без проведения деэпителизации, предложенная A. Kanellopoulos в 2009 г., с использованием фемтолазера. Согласно данной методике раствор рибофлавина вводится в роговичный карман, сформированный фемтосекундным лазером на глубине 100 мкм, с последующим УФ облучением мощностью 7 мВт/см² в течение 15 минут. В ходе почти 2-летнего наблюдения автор отмечает «уменьшение сферического и цилиндрического компонентов рефракции, а также значений максимальной кератометрии с 48,7 до 47,90 дптр, повышение остроты зрения» [81].

    Таким образом, методика УФ-кросслинкинга в последнее десятилетие привлекает все большее внимание. Клиническими исследованиями была продемонстрирована не только остановка прогрессирования кератэктазии, но и улучшение остроты зрения.

    Были предприняты попытки оптимизации КРК для уменьшения боли и дискомфорта пациента после операции, а также для сведения к минимуму осложнений на тонкой роговице.

    Хотя безопасность КРК была продемонстрирована в многочисленных экспериментальных исследованиях на животных, клинические результаты не всегда предсказуемы и сохраняется вероятность повреждения глубжележащих слоев роговицы, а также имеется риск инфекционных осложнений при обширной деэпителизации. Послеоперационный период может достаточно сильно различаться в зависимости от стадии кератоконуса, возраста и пола пациента и техники КРК. В клинических исследованиях стандартного КРК были зарегистрированы такие осложнения, как отек, помутнение стромы и инфекционный кератит.

    Учитывая перспективность трансэпителиальных модификаций КРК, в частности методик с применением фемтолазера, а также доказавшей свою эффективность методики локального персонализированного КРК, предложенной проф. С.И.Анисимовым с соавт., одновременно принимая во внимание недостатки указанных методик (болевой синдром, риск инфекционных осложнений и помутнений в оптической зоне роговицы), представляется целесообразной разработка технологии циркулярного тоннельного УФ-кросслинкинга с фемтолазерным формированием кольцевидного интрастромального кармана для введения фотосенсибилизатора при периферическом расположении верхушки эктазии, уменьшающего интенсивность послеоперационного роговичного синдрома и риск осложнений, сохраняющего интактной центральную зону роговицы при равной эффективности метода в сравнении со стандартной техникой КРК.